大孔聚磷酸钙壳聚糖复合材料的制备

大孔聚磷酸钙壳聚糖复合材料的制备

骨是自然界最复杂、最有效的材料。而单一的无机材料和单一的有机材料都难以满足临床上对骨修复材料的生物活性及生物力学性能的综合要求。所以,用于骨组织工程的材料,一般都是无机和有机的复合材料,它综合了有机组分的韧性和无机组分的刚性,是具有综合使用性能的骨修复复合材料。文献上所报道的复合骨修复组织工程材料,通常是用生物活性陶瓷与合成高分子材料或天然高分子材料进行复合。而用聚磷酸钙(CPP)和壳聚糖(CS)复合用于骨修复材料的研究,迄今未见有文献报道。无机陶瓷CPP具有生物相容性、生物活性、骨传导性等优点,但是脆性、降解速率太慢,满足不了骨修复的要求。有机成分CS是来源丰富的天然高分子材料,具有优异的生物相容性和生物可降解性,可促进成骨细胞在其表面黏附、分化和增值,但是其生物活性低,即缺乏与骨键合的生物活性,降解速率较快。将CPP和CS复合,可以取长补短,提高其力学性能和细胞相容性。为了增加CPP的韧性和提高其力学性能,本文用CS和CPP为原料,硬脂酸(Sad)为致孔剂,采用悬浮液热分散复合法,用不同的工艺分别合成出了大孔复合材料棒材及微孔复合材料颗粒。用红外光谱(IR)和扫描电镜(SEM)研究了其化学结构和形态结构,重点研究了2种工艺所得复合材料的力学性能和细胞相容性,发现材料的孔径较大时,有利于细胞的生长和繁殖,复合材料中CPP含量增加时,细胞相容性增加,且力学性能增加。探索了不同工艺和不同配比对CPP/CS复合骨修复材料细胞相容性和力学性能的影响规律。这将为CPP/CS复合骨修复材料在临床上的应用提供研究依据。1实验部分1.1实验室和试剂壳聚糖:分子量分别为8.5、19.7、31.8、42、53.5、65万,脱乙酰度分别为67.5%、71.34%、75.56%、78.23%、82.14%、85.46%、91.2%,食品级,由上海卡博工贸有限公司和青岛海汇生物工程有限公司生产;聚磷酸钙:实验室自行制备,粒径为35、50、74、125、147、175、300μm;硬脂酸:分析纯,粒径范围为50~300μm,成都科龙化工试剂厂;乙酸(HAC):分析纯,成都科龙化工试剂厂;无水乙醇:分析纯,含量为99.7%,成都科龙化工试剂厂;氢氧化钠:分析纯,成都科龙化工试剂厂;乙醚:分析纯,成都科龙化工试剂厂;透析袋:截留分子量10000,天泰试剂公司。1.2cpp-cs材料的合成1.2.1复合悬液的制备在250mL的三颈瓶中加入4.00gCS粉末和6.70gSad颗粒的混合料,加入96.00g2vol%HAC溶液,在65℃搅拌溶解1h。用10mL无水乙醇搅拌分散6.00gCPP,加入三颈瓶中再搅拌3h。将复合悬液装入透析袋,放入5wt%NaOH溶液中浸泡24h。蒸馏水漂洗至中性,分别用乙醚和乙醇浸溶出Sad,再用蒸馏水漂洗12h后室温晾干。1.2.2cpp复合悬液的制备在250mL的三颈瓶中加入4.00gCS粉末,再加入96.00g2vol%HAC溶液,在65℃搅拌溶解1h。用10mL无水乙醇搅拌分散6.00gCPP,加入三颈瓶中再搅拌3h。将复合悬液滴入5%NaOH溶液中浸泡24h。蒸馏水漂洗至中性后室温晾干。1.3孔径及孔隙率在美国尼高力仪器公司生产的Nicolet520型傅里叶变换红外光谱仪上测定复合材料的IR谱。用日本电子公司生产的JSM-5900LV型扫描电子显微镜观察并拍摄复合材料断面的形态照片,测定复合材料的孔径。用乙醇渗透法测定CPP/CS多孔复合材料的孔隙率。将样品制成直径相同、高度相同的圆柱体,在美国INSTRON公司生产的4302型万能材料实验机上测定压缩强度。1.4本材料对细胞的适应性试验1.4.1细胞免疫酶活性测定材料称重,密封后经γ射线灭菌,以每1g样品加入10mL细胞培养液,在37℃,5vol%CO2无菌条件下浸提72h作为浸提液。将细胞密度为1×104个/mL的内皮细胞悬液,接种96孔板,每孔200μL,置于37℃±2℃,5vol%CO2培养箱中开放培养24h,使细胞贴壁。弃去培养液,加入等量的浸提液,再放入37℃±2℃,5vol%CO2的培养箱内分别培养2、4、6天。在各观察期(2、4、7天),弃去培养皿内的浸提液和培养液,加入20μL/孔的噻唑蓝(MTT)液,继续培养4h,吸去原液,加入150μL/孔二甲基亚砜(DMSO),震荡10min,在免疫酶标仪上以490nm波长测定吸光度值。细胞的相对增殖度(RGR)按下式计算:RGR=实验组平均吸光度值阴性对照组平均吸光度值×100%RGR=实验组平均吸光度值阴性对照组平均吸光度值×100%1.4.2细胞生长特性的测定将材料置于24孔板中,将成骨细胞悬液(浓度为5×104个/mL,DMEM培养液中含10wt%小牛血清)用微量加样器接种于24孔培养板上,每孔2000μL细胞悬液。置于37℃±2℃,5vol%CO2培养箱中开放培养7天,于第6天用微量移液枪吸出1mL培养液再加入新鲜培养基1mL。在此期间采用倒置相差显微镜给样品拍照以观察细胞在材料上的生长情况。固定:将细胞与支架材料复合培养到预定时间后,从孔板中取出材料,采用磷酸缓冲溶液(PBS)漂洗2遍后,放入青霉素小瓶中,加入4℃预冷的3wt%戊二醛,在4℃固定2h或过夜,吸出固定液,用PBS浸洗2次,每次10min。脱水:用系列质量浓度的梯度酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)脱水,每种浓度酒精通过2次,每次15min。干燥:采用临界点干燥法干燥,真空喷金后放入扫描电子显微镜观察。2结果与讨论2.1氢键生成分析从图1可知,在复合材料的图谱中,没有722.48cm-1和549.34cm-1硬脂酸的基团吸收峰和—COOH的吸收峰,说明复合材料中的Sad已经全部溶出了。在3000cm-1有一个肩峰,表明有氢键的存在,说明CS的氨基和CPP的Ρ=Ο基生成了氢键,这也是复合材料紧密且有强度的原因。微孔复合材料颗粒的FTIR与此相同。图2(a)是CPP/CS大孔复合材料棒材的SEM照片,通过SEM分析,观测了大孔复合材料棒材的孔径和形态结构,其孔径范围为50~300μm,形态结构致密均匀;用乙醇渗透法测定材料的孔隙率为71.13%,满足组织工程骨修复材料对孔径和孔隙率的要求。图2(b)是CPP/CS微孔复合材料颗粒的SEM照片。通过SEM观测到微孔复合材料颗粒的孔径范围为10~100μm,测定出其孔隙率为40.76%,形态结构致密均匀。2.2原料配比对复合材料细度的影响用分子量为42万、脱乙酰度为75.56%的CS,用粒径为50μm的CPP,按不同的质量配比合成出复合材料,其压缩强度与CPP含量的关系见图3。由图可见,CPP与CS复合可以提高CPP的压缩强度,原料配比为CPP/CS=5/5、6/4、7/3时,复合材料的强度较高,而当CPP/CS=7/3时,强度最高,说明接近人体骨中无机/有机的质量比例时性能最好。大孔复合材料棒材比微孔复合材料颗粒的压缩强度高,因为棒材是在透析袋中,沉析很紧密,强度高;而颗粒是在NaOH溶液中浸泡,较疏松,强度低。2.3材料的细胞兼容性2.3.1大孔复合材料棒材细胞透气性分析图4是不同配比的复合材料培养细胞的生长曲线及阴性对照曲线。从曲线可以看出,无论是大孔复合材料棒材,还是微孔复合材料颗粒,配比为CPP/CS=7/3时的复合材料的细胞相容性均较好。从图4可知,大孔复合材料棒材的细胞相容性比微孔复合材料颗粒的细胞相容性好,其原因是大孔复合材料棒材的空隙较大,其中的杂质等小分子物质容易被蒸馏水漂洗除去;而微孔复合材料颗粒的空隙较小,其中的杂质等小分子物质不容易被蒸馏水漂洗除去,对细胞的生长有一定影响。复合材料的细胞相容性不如单一材料好,这可能是复合材料经过复合、沉析、漂洗等步骤会引入杂质的缘故。2.3.2料棒材与复合材料的rgr比对表1为不同配比复合材料棒材和颗粒样品的RGR值。从表1可知,复合材料棒材的RGR值都比复合材料颗粒的高,且CPP/CS=7/3时的复合材料的RGR比其他配比的高。再次说明棒材的细胞相容性比颗粒的好,当复合材料的配比为CPP/CS=7/3时,复合材料的细胞相容性最好。2.3.3大孔复合材料的生长用分子量为42万、脱乙酰度为75.56%的CS,和粒径为50μm的CPP,按质量配比为CPP/CS=7/3合成出大孔复合材料棒材及微孔复合材料颗粒。成骨细胞在材料上生长的SEM照片如图5所示。从图5所知,成骨细胞在大孔复合材料棒材上生长情况良好,而在微孔复合材料颗粒上几乎不能生长。这是因为后者的空隙太小,不能提供成骨细胞生长的足够大的空间,即不利于细胞的生长。3悬浮液热分散法ftir分析(1)所合成的CPP/CS大孔复合材料棒材,具有均匀密集的大孔,孔径范围为50~300μm,孔隙率为71.13%,适合骨修复材料对孔径和孔隙率的要求。(2)从SEM照片可以看出,CS和CPP在复合材料中的分布是均匀的;从FTIR