槐米中芦丁的提取及高纯度鉴定

槐米中芦丁的提取及高纯度鉴定

芦笋，也被称为玉香茶，广泛存在于植物界。目前发现的50多份植物含有芦笋，其中蝗虫和小麦的含量最高，可以提取大量芦笋。芦丁属于黄酮类化合物,在心脑血管疾病的治疗上起到了举足轻重的作用,具有VP样作用。有助于保持毛细血管正常弹性,同时还有抗炎、抗病毒、抗氧化等作用。其临床效果肯定,副作用少,同时也是一种植物原料药。本实验拟探究一种实验室制备高纯度芦丁的方法,用作对照品或满足其他特殊需要的试剂。1材料和机器1.1测试剂芦丁标准品(中国药品生物制品鉴定所),甲醇为色谱醇,其它试剂均为分析纯,水为重蒸水。芦丁购于延大医附院药房经鉴定无误。1.2色谱作业单位器日本岛津高效液相色谱仪(LC10ATvp溶剂输送泵,SPD10Avp紫外可见检测器,CTO10Asp柱温箱),HW2000色谱工作站(南京千谱软件公司)。电子分析天平(型号BS124S),JB202-电热恒温干燥箱(上海金忠科学仪器有限公司制造),DL-360超声波清洗皿(浙江象山县石浦海天电子仪器厂),TGL-16台式高速离心机(上海冠戈实业有限公司制造),紫外分光光度计(2401PC-日本岛津)。2方法和结果2.1量饱和石灰水液微采用酸提碱沉法:称取槐米粉,置500mL烧杯中,加沸水、硼砂搅拌,于石棉网上加热至微沸,然后加入适量饱和石灰水溶液,保持pH8~9之间,并不断地搅拌,微沸30min后,过滤,滤液收集。以同法再次收集滤液并合并,待滤液温度降至60~70℃之间时用浓盐酸调pH4~5之间,当温度降至室温时放入冰箱静置12h,使沉淀完全,抽滤,沉淀,用蒸馏水洗至中性,干燥得粗品芦丁,蒸馏水重结晶,得精制芦丁。2.2葡聚糖凝胶柱顶聚酰胺膜的制备用葡聚糖凝胶柱进一步分离纯化,称取精制芦丁0.25g,用少量甲醇使之溶解,加入葡聚糖凝胶柱顶,用甲醇洗脱,试管收集,15mL/管,共收集22管,用聚酰胺膜鉴定芦丁并作如下合并收集液。第1瓶1~10管,第2瓶11~22管;然后水浴浓缩至原液的一半,冷置,仅第一瓶出现黄绿色微细针状结晶,再继续浓缩,60℃干燥即得芦丁纯品。2.3鲁丁的鉴定2.3.1点管法点管法本品为黄色结晶粉末,熔程为188~190℃(梯勒熔点管法),盐酸镁粉反应呈阳性;氨性氯化锶反应呈阳性显示有邻二酚羟基;锆盐枸橼酸反应呈阳性显示有3及5-羟基存在。水解液用薄层层析鉴定,显示有葡萄糖及鼠李糖存在。2.3.2水、甲醇、醋酸乙酯甲醛用3cm×5cm的聚酰胺膜,选3种展开剂:分别为A,丙酮∶水(3∶1);B,氯仿∶甲醇(5∶4);C,醋酸乙酯∶甲酸∶水(8∶1∶1)。氨熏后喷显色剂3%的三氯化铝显色,经重结晶的芦丁样品在上述3种展开剂中均只显一个斑点。2.3.3氢磁共振法的发现芦丁样品与芦丁标准品图一致。2.4测定了石膏含量hplc法2.4.1对照品及样品流动相为甲醇4.3%乙酸(55∶45),应用前经混合纤维素酯微孔滤膜过滤,超声脱气,流速为1.0mL/min,进样量为20μl,检测波长为254nm,芦丁的出峰时间为3~4min,该色谱条件下对照品及样品的色谱一致。2.4.2紫外分光光度计检测配置芦丁标准品溶液浓度为0.002.04mg/mL在紫外分光光度计中扫描,结果显示最大吸收波长有214、254、360nm,由于在214nm处干扰因素多,因此高效液相选择在254nm处测定。2.4.3样品2号的制备精密称取经变色硅胶干燥的芦丁标准品0.01005g,芦丁样品1号(为经过葡聚糖凝胶柱分离的)0.01005g,芦丁样品2号(未经葡聚糖凝胶柱分离的)0.01002g,分别置于50mL容量瓶内,用甲醇定容,在超声清洗皿中超声3min,使之全部溶解,然后在分别倒少量入EP管中离心10min,12000r/min。得芦丁标准品溶液浓度为0.201mg/mL,芦样1号浓度为0.2001mg/mL,芦样2号浓度为0.2004mg/mL。2.4.4标准曲线的绘制芦丁标准品溶液的浓度为0.2001mg/mL,将其稀释成1,1/2,1/4,1/16,1/64,1/256系列浓度,编号为1,2,3,4,5,6,吸取20μl进样,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线如下,进行线性回归处理,求出回归方程:Y=4E+07X-2660.2,r=0.9996,浓度单位是mg/mL,峰面积的范围在228710.5μV·s~7494036.5μV·s内。结果表明芦丁的浓度在0.00628125~0.201mg/mL范围内,浓度与峰面积呈良好的线性关系。2.4.5样品的质量分析将配制好的芦丁样品1号,2号进样,测得峰面积,然后代入标准曲线得浓度。测得样品的含量为98.05%。2.4.6标准品溶液的测定分别取3份已知浓度的样品1号溶液0.8mL放入EP管中,在分别加标准品溶液0.1,0.2,0.3mL,甲醇0.2,0.1,0mL,定于1.1mL,离心10min,12000r/min,结果见附表。2.4.7试验的精密度精密量取芦丁样品1号溶液1mL放入EP管中,离心10min,12000r/min.供试品5次测量结果RSD%为0.33,小于2.0%,说明本试验的精密度较好。2.4.8甲醇离心时间的确定精密量取芦丁样品1号溶液0.8mL于EP管中,在加0.2mL甲醇,分别做5份,离心10min,12000r/min。RSD%0.44,小于2.0%,说明本实验的重现性较好。3葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物用酸提碱沉法提取芦丁具有工艺简单、效率高和较经济等优点,采用高效液相法测定芦丁的含量,该法使用的试剂常见,方法精确、灵敏、线性范围宽,稳定性和重现性均能满足要求。测得芦丁的含量为98.05%,可以代替对照品测定物质的含量和满足其它特殊需要的试剂。在芦丁的提取工艺中,由于用的是酸提碱沉法,所以加入的石灰水的量和浓盐酸的量是本试验的关键,当pH为10时,产品质量为1.5g,当pH为9时,产品质量为2.3g,当pH为8时,产品质量为1.97g,当pH为7时,产品质量为1.10g。葡聚糖凝胶对分离黄酮类化合物效果很好,此方法即简便,又适合实验室操作。实验产品纯度高,含量达98.05%,可代替芦丁标准品测定芦丁制剂中的芦丁含量。实验中笔者发现芦丁极易被氧化变色,要注意避光干燥保存。选择沸水溶液提取以破坏酶,