流感病毒分离鉴定

流感病毒分离鉴定

流感病毒的突变是快速发生的。人们通常很容易感受到这种感觉。如果它在短时间内大量传播，将对人类健康构成威胁。加强流感监测工作,及时发现流感病毒的变异,为有效应对流感爆发或大流行提供科学依据,2012年5月新疆克孜勒苏柯尔克孜自治州(简称克州)疾病预防控制中心流感网络实验室开展了流感病毒细胞培养分离技术的初步应用,结果报告如下。1材料和方法1.1流感病患者作为流感学样本经克州疾病预防控制中心流感网络实验室实时PCR检测阳性(4例为新甲型H1N1,10例为乙型流感)的14份流感患者咽拭子样本。采集好的咽拭子,立即放入含病毒采样液的病毒采样管内,震摇后置于-70℃冰箱保存待检。1.2免疫组化产品狗肾传代细胞(MDCK)由新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心传染病防治科配发,克州疾病预防控制中心流感病毒分离实验室液氮罐中冻存。所用鉴定血清和抗原均由中国疾病预防控制中心流感中心配发。DMEM培养液、胎牛血清、HEPES、0.25%EDTA-胰酶、TPCK胰酶均使用新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心传染病防治科统一配发美国进口产品,均在有效期内使用。双抗(青霉素、链霉素)使用国产有效期内产品。细胞生长液、细胞维持液、倒置显微镜、CO2培养箱、生物安全柜、1ml无菌移液管、10ml无菌移液管、15ml无菌离心管、无菌T25细胞培养瓶、96孔U型微量血凝板、移液器及吸头等。1.31%人o型红细胞由克州中心血站提供,所用红细胞用PBS连续洗3遍,配制成1%人O型红细胞悬液,放入4℃冰箱待用。1.4mdck细胞接种的准备和接种MDCK细胞生长液、细胞维持液严格按自治区疾病预防控制中心传染病防治科流感网络实验室提供的标准配方配制,并以NaHCO3溶液调pH7.2～7.4。液氮罐中冻存的MDCK细胞复苏,MDCK细胞培养成75%～90%成片细胞T25细胞瓶的准备,流感病毒MDCK细胞培养分离方法,红细胞凝集试验(HA),红细胞血凝抑制试验(HI)均按自治区疾病预防控制中心传染病防治科流感网络实验室提供的标准方法和标准操作程序进行。MDCK细胞培养CO2培养箱温度为37℃、5%CO2。MDCK细胞标本接种后培养温度为33℃。MDCK细胞75%～95%成片细胞的T25细胞培养瓶准备:MDCK细胞培养2～3d后,将细胞培养瓶置于倒置显微镜下观察细胞培养生长情况,当MDCK细胞平铺底部75%～95%,即可用于标本的接种。MDCK细胞标本接种后33℃培养7～10d,当75%～100%MDCK细胞出现病变时进行收获,收获病毒上清液测定血凝效价。样本第一代红细胞凝集试验阴性,可用收获的全部上清液盲传,盲传两代后仍为阴性则弃之。2结果2.1病毒分离和鉴定流感病毒能够与豚鼠、鸡红细胞或人O型红细胞发生凝集,检测流感病毒及其病毒滴度就是根据这一特性而进行的。试验使用1%人O型红细胞悬液,并作阴性对照。经红细胞凝集试验14份标本中,病毒分离物血凝HA滴度≥1∶32的有4号、6号、10号标本,病毒分离阳性。其余11份标本血凝HA滴度均<1∶4,盲传两代HA滴度仍均<1∶4弃之。2.2血凝抑制试验(HI)鉴定流感病毒型别使用已处理好4个血凝单位的流感新甲型H1N1、乙型Yamagata系(BY)、乙型Victoria系(BV)标准血清,1%人O型红细胞悬液,将HA滴度≥1∶32的4号、6号、10号阳性标本病毒培养分离物用血凝抑制试验(HI)试验进行鉴定。4号标本新甲型H1N1阴性,BY为1∶8,BV为1∶128。6号标本新甲型H1N1阴性,BY为1∶4,BV为1∶128。10号标本新甲型H1N1阴性,BY为1∶4,BV为1∶128。分离出的3株病毒鉴定结果均为B型流感病毒,与本实验室实时PCR检测结果相符,见表1。3流感病毒mdck细胞培养分离积累经验的总结在标本中分离到病毒是诊断病毒感染的“金指标”。狗肾传代细胞(MDCK)是目前用于流感病毒分离培养最常用的敏感细胞系,克州疾病预防控制中心流感实验室应用MDCK细胞培养法分离流感病毒,可同时提供大量的、重复性好的、生物学性状相似的MDCK细胞用于病毒分离,经济方便,病毒分离阳性率高,可长期开展流感病毒监测工作。目前新疆地(州)级疾病预防控制中心均已开展流感病毒MDCK细胞培养分离技术,但部分地(州)至今未能成功分离出流感病毒。流感病毒细胞培养分离技术的初步应用在克州疾病预防控制中心首获成功,成功分离出流感病毒,为今后流感病毒细胞培养分离积累经验,为流感监测提供科学技术支持。由于流感病毒MDCK细胞培养分离技术操作较复杂,MDCK细胞娇嫩、易污染,对检验人员和实验条件的要求高。本次流感病毒MDCK细胞培养分离实验,是用经本实验室实时PCR检测流感阳性的14份流感患者咽拭子样本进行MDCK细胞培养分离流感病毒,主要是为以后的流感病毒MDCK细胞培养分离积累经验。本次试验体会如下:(1)使用冻存的MDCK细胞种子控制在10代以内。MDCK细胞培养2～3d后,细胞已平铺底部75%～95%的对数生长期接种病毒,有利于流感病毒的复制。(2)用于流感病毒MDCK细胞培养分离的标本应使用新鲜标本,尽快分离病毒。48h内分离的可以保存在4℃,超过48h-70℃冻存,尽快分离,避免反复冻融。(3)收获病毒之前可以将细胞放于-70℃冰箱,冻融1～2次,以提高收获标本的病毒滴度。(4)每个标本应平行接种2瓶,以便流感病毒分离阳性时,有足够的收获标本量上报国家流感实验室。(5)流感病毒细胞培养分离实验整个过程一定要无菌操作。培养细胞的培养液营养丰富,培养细胞的过程中易发生微生物污染,操作须在生物安全柜内进行,培养液需添加抗生素预防和控制微生物污染的发生。(6)要用新鲜的人“O”型血配制1%的红细胞悬液,配制必须标准化,每次使用时要混匀。(7)稀释液被细菌污染或血清受细菌污染变质时对红细胞凝集抑制试验结果产生很大影响。(8)HI实验须新鲜准确配制4u/25µl的抗原,应进行红细