米曲霉沪馏302固态发酵产白腐菌的研究

米曲霉沪馏302固态发酵产白腐菌的研究

美沙梅是中国传统的加工食品品种，如酒精食品和餐饮。人们知道美国的米曲霉菌生产了许多酶系统和复杂的酶系。日本的研究人员发现了美沙霉组。然而，关于这类植物在中国的酶系统发育过程中受到的影响及其酶系统的影响尚不清楚。另一方面，在工业生产过程中，美国的霉菌生产过程无法得到很好的控制。另一方面，这类传统植物在工业应用中的地位还没有完全扩大。本实验对米曲霉（Aspergillusoryzae)M-9的3种主要酶在固体发酵过程中所受的影响及活性的变化进行了研究，探讨利用木质纤维原料低成本生产酶系丰富的工业酶制剂的可行性，同时为深入了解这些酶在食品酿造过程中的作用提供理论依据。1材料和方法1.1米曲霉的分离米曲霉（Aspergillusoryzae)M-9，运用透明圈法从王致和集团公司提供的米曲霉沪酿3.042的曲精中筛选分离而来，以PDA斜面培养基30℃～32℃恒温培养并保存。1.2培养基和膏桦木木聚糖、低黏度羧甲基纤维素：购于Sigma公司；酪蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏：购自北京双旋培养基制造厂；蔗渣、玉米芯及麸皮：购自北京郊区；其他试剂均为国产分析纯。1.3培养基培养方法制备孢子悬液：将10mL无菌水加入到在30℃条件下培养了3d～4d的PDA斜面培养基，用灭菌的接种环在培养基表面轻轻刮动，制成孢子悬液，混匀后用血球计数板计孢子数，调整孢子悬液的孢子数为106个/mL。营养盐溶液：KH2PO41g/L、NaCl2.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、（NH4)2SO41g/L、CaCl20.5g/L，调节pH值至7.0。发酵培养：在250mL三角瓶中加入5g风干后过筛的木质纤维原料和15mL营养盐溶液，拌匀，121℃灭菌30min，冷却后按每瓶固体培养基1mL孢子悬液（106个/mL）接种，搅拌均匀后，于32℃培养72h。粗酶液的制备：每克固态培养物加入5.0mL、pH7.2的磷酸缓冲溶液，室温下浸提1h,10000×g离心10min，上清液即为粗酶液。1.4酪氨酸的测定蛋白酶活性的测定参照FERREIAG等的方法：1.0mL适当稀释的酶溶液，加入到1.0mL用0.1mol/L、pH7.0柠檬酸钠缓冲液配置的1%酪蛋白底物溶液中，40℃反应10min，用0.5mL0.3mol/L三氯醋酸溶液中止反应。反应液混匀后8000×g离心10min，释放的酪氨酸按照LOWRYOH方法等的测定，同时以酪氨酸作为标准绘制标准曲线。蛋白酶活性单位（U）的定义为：在上述条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μmol酪氨酸所需的酶量。木聚糖酶活性的测定参照DNS法：0.1mL适当稀释的酶溶液，加入到0.9mL用0.05mol/L、pH6.5柠檬酸钠缓冲液配制的1%桦木木聚糖底物溶液中，50℃反应5min，用DNS法测定释放的还原糖量，同时以木糖作标准。木聚糖酶活力单位（U）的定义为：在上述条件下，每分钟水解木聚糖生成1μmol木糖所需的酶量。纤维素酶活性：方法同上，仅将底物和标准物分别换成低粘度羧甲基纤维素和葡萄糖。纤维素酶活性单位（U）的定义为：在上述条件下，每分钟水解低黏度羧甲基纤维素生成1μmol葡萄糖所需的酶量。2结果与讨论2.1实验结果分析采用蔗渣、玉米芯、作麸皮作为单一碳源进行固体发酵实验，结果见表1。在所选碳源中，麸皮作为碳源米曲霉发酵产生的蛋白酶及木聚糖酶量均相对较高，玉米芯作为碳源时产酶量稍低，而蔗渣作为碳源时产酶效果最差。2.2发酵试验结果微生物酶的合成同时受酶诱导物和酶蛋白质前体的调控，酶诱导物一般为可利用的碳源，而酶蛋白质的前体主要来自于氮源，因此氮源的类型和性质同样会影响酶的合成和分泌。选择不同氮源作为单一氮源进行发酵试验，来考察对米曲霉产酶的影响。结果见表2。从表2可看出，氮源对米曲霉蛋白酶生产的影响很大。在实验选用的8种有机和无机氮源中，以蛋白胨作为单一氮源时米曲霉所产蛋白酶活性最高；酪蛋白胨和酵母浸膏次之，米曲霉所产蛋白酶分别是蛋白胨作为单一氮源时活性的94%和91%；当分别以硫酸铵和氯化铵为单一氮源时，米曲霉所产蛋白酶活性仅为最高酶活性的32%和21%。实验发现米曲霉所产的木聚糖酶和纤维素酶受氮源影响的程度与其蛋白酶并不同步：尿素是其产生最高木聚糖酶活性及纤维素酶活性的一种氮源，而在此条件下米曲霉仅能产生相对最高活性71%的蛋白酶。2.3初始ph值对米曲霉蛋白酶表达的影响微生物在生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，导致培养基pH值发生变化，而培养基初始pH值不仅影响微生物的生长繁殖，且对其产酶情况有显著的影响。在优化碳氮源基础上，调节培养基初始pH值为5.0～9.0来考察对米曲霉产酶的影响，结果（图1A）表明，米曲霉产生蛋白酶的最佳培养基初始pH值为6.0～8.0，当培养基初始pH值为5.0，米曲霉仍能产生相对于最高活性72%的蛋白酶；而当培养基初始pH值调至9.0时，米曲霉产生蛋白酶量则迅速下降至最高活性的34%，表明米曲霉产蛋白酶虽可在较宽的培养基初始pH值范围内，但碱性环境不利于米曲霉蛋白酶的生产。尽管米曲霉木聚糖酶和纤维素酶的产生也在一定程度上受到培养基初始pH值的影响，但是与米曲酶蛋白酶相比较，一方面其受影响的程度低于蛋白酶，另一方面米曲霉产生此2种酶的最佳培养基初始pH值范围属于中性偏碱，如纤维素酶活性在pH8.0时达最高。另外，在调节培养基初始pH值至最佳的基础上考察了培养温度对米曲霉产酶的影响，结果（图1B）表明，当培养温度为30℃时菌株所产酶活性最高；当温度升高至45℃时，蛋白酶活性仅为最高值的35%，木聚糖酶和纤维素酶活性也分别降至最高值的46%和51%。可知在30℃条件下较为利于米曲霉的菌丝生长及产酶。2.4米曲霉的蛋白酶特性在优化的发酵条件下，米曲霉固体发酵的产酶过程见图2。由图2可知，从培养24h开始米曲霉开始蛋白酶的迅速合成，至培养48h时产生最高活性的蛋白酶，随后产酶量迅速下降至最高值的50%。米曲霉产生木聚糖酶和纤维素酶的趋势与蛋白酶基本一致。国内酱油生产中沪酿3.042米曲霉的制曲时间为36h～42h，也是由于在此时间段米曲霉菌所产各种酶处于高峰期。2.5米曲霉酶系统成分的初步检测在不同条件下对米曲霉的产酶酶系进行分析，测试条件及结果（表3）表明，米曲霉在实验所采用的固体发酵条件下的产物中，中性蛋白酶的量最大，除此之外，还有一定量的碱性蛋白酶及酸性木聚糖酶、纤维素酶。3初始ph值及培养温度对菌株发酵的影响研究了米曲霉菌株M-9发酵条件及酶系分析。实验表明，此菌株固态发酵最适碳源为麸皮，最适氮源为蛋白胨，菌株发酵最适