N-亚油酰酪氨酸诱导PC12细胞通过自噬抗氧化

成都医学院学士学位论文（设计）2题目：N-亚油酰酪氨酸诱导PC12细胞通过自噬抗氧化目录摘要Ⅰ关键词ⅠAbstractⅡKeywordsⅡ前言11材料11.1PC12细胞11.2试剂11.3仪器22方法22.1细胞培养及实验分组22.2细胞计数32.3免疫荧光32.3.1细胞铺板32.3.2一抗及一抗前处理32.3.3孵育二抗及荧光拍照32.4免疫印迹（Westernblot）32.4.1细胞铺板32.4.2细胞蛋白的提取32.4.3Westernblot实验的制胶42.4.4SDS电泳缓冲液的配制42.4.5电泳与切胶转模42.4.6封闭42.4.7一抗孵育42.4.8二抗孵育42.4.9凝胶成像42.5细胞存活率检测（MTT法）42.6数据处理43结果53.1CB2受体拮抗剂AM630逆转NITyr的作用53.2NITyr对PC12细胞CB1和CB2蛋白的作用53.3NITyr对PC12细胞自噬蛋白ATG5、BCL-2的作用63.4NITyr对PC12细胞自噬蛋白Beclin1、LC3和ATG13表达的影响74讨论9结论10参考文献10致谢12诚信说明12

ⅠⅡN-亚油酰酪氨酸诱导PC12细胞通过自噬抗氧化摘要目的：探讨了N-亚油酰酪氨酸（N-iminoylTyrosine，NITyr）对氧化损伤的PC12细胞产生的自噬相关蛋白LC3、Beclin1、ATG5、ATG13和抗细胞凋亡蛋白BCL-2表达量的影响，从而研究NITyr能否诱导PC12细胞通过自噬抗氧化损伤。方法：通过过氧化氢损伤诱导PC12细胞建立氧化损伤模型，分别加入CB1和CB2受体抑制剂观察是否逆转NITyr对细胞活力的作用，采用Westernblot和免疫荧光方法测定自噬相关蛋白（LC3、Beclin1、ATG5、ATG13和BCL-2）的表达以及CB1和CB2的蛋白表达。结果：CB1受体抑制剂AM251不能逆转NITyr对细胞活力的作用，而CB2受体抑制剂AM630能逆转NITyr的作用，且NITyr能抑制CB2受体蛋白的表达，但对CB1受体无作用。在氧化损伤环境中，细胞中总的LC3、Beclin1、ATG5、BCL-2和ATG13蛋白表达下调；NITyr在1μmol/L和5μmol/L浓度下能上调上述蛋白。且不同蛋白在三种浓度（0.5、1和5μmol/L）NITyr作用下，其表达水平高低不同，1μM浓度下作用最佳。结论：NITyr能通过诱导氧化损伤的PC12细胞自噬，使自噬相关蛋白表达增加，从而发挥抗氧化作用，此过程可能与CB2受体有关。关键词N-亚油酰酪氨酸；自噬；氧化损伤；大麻素受体N-iminoylTyrosineInducesAntioxidationofPC12CellsthroughautophagyAbstractObjective:TostudytheeffectsofN-iminoyltyrosine(NITyr)ontheexpressionofautophagy-relatedproteinsLC3,Beclin1,ATG5,ATG13andBCL-2inoxidativedamagedPC12cells,soastoinvestigatewhetherNITyrcaninducePC12cellstooxidativedamagethroughautophagy.Methods:ToestablishtheoxidativedamagemodelofPC12cellsinducedbyhydrogenperoxide,andCB1andCB2receptorinhibitorswereaddedtoobservewhethertheycouldreversetheeffectofNITyroncellviability.Thentheexpressionofautophagy-relatedproteins(LC3,Beclin1,ATG5，ATG13andBCL-2)andtheexpressionofCB1andCB2weredeterminedbyWesternblotandimmunofluorescence.Results:CB1receptorinhibitorAM251couldnotreversetheeffectofNITyroncellviability,whileCB2receptorinhibitorAM630couldreversetheeffectofNITyr,andNITyrcouldinhibittheexpressionofCB2receptorprotein,buthadnoeffectonCB1receptor.Inoxidativedamageenvironment,thetotalexpressionofLC3,Beclin1,ATG5,BCL-2andATG13wasdown-regulated,andNITyrcouldup-regulatetheseproteinsat1and5μMmol/Lconcentrations.Theexpressionlevelsofdifferentproteinsweredifferentunderthreeconcentrations(0.5,1and5μMmol/L)ofNITyr,andtheeffectof1μMwasthebest.Conclusions:NITyrcanincreasetheexpressionofautophagy-relatedproteinsbyinducingautophagyofoxidativedamagedPC12cells,thusexertingantioxidanteffect.ThisprocessmayberelatedtoCB2receptor.KeyWordsN-iminoylTyrosine;autophagy;oxidativedamage;Cannabinoidreceptor1前言在体内有害因素刺激下，机体发生的体内自由基增加或抗氧化保护能力减弱，致氧化和抗氧化系统平衡的失调。在此状态下过多积累的活性氧，会造成核酸、蛋白质和脂质等生物分子的损伤，进而导致心血管疾病、慢性退行性疾病诸如阿尔茨海默症（Alzheimersdisease,AD）或帕金森症等的发生和发展。细胞中的氧化和抗氧化系统平衡的失调是氧化应激造成细胞损伤的一个原因，该过程产生的活性氧亦是细胞发生自噬的一个诱因，受损的蛋白质和细胞器可通过自噬降解，从而缓解损伤，保护细胞，所以自噬和氧化应激之间相互影响。抗氧化剂可通过中和自由基、消除或防止氧化剂转变为毒性更强的化合物，减缓或抑制细胞损伤，达到抗氧化的目的［1］。细胞自噬是真核细胞处理自身产生的受损坏的蛋白和细胞器等生物大分子的过程。正常生理下，细胞稳态的维持只需要少量的自噬，但在细胞内外刺激（如营养缺乏、低氧［2］、小分子化合物和激素［3］等）诱导作用下，细胞大量自噬的形成则由细胞信号通路转导诱导。越来越多研究结果提示，机体的全身肿瘤［4］、神经退行性疾病［5］、和心脏疾病等的发生发展和治疗均与细胞的自噬不足或过量自噬有关。囊泡核化的激活由应激信号触发，从而形成自噬，在此阶段，由雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）和Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶复合物两种激酶发挥重要作用［6］。而自噬相关蛋白（autophagy-relatedprotein,Atg）ATG13、ATG5、Beclin1、LC3控制自噬的延伸［7］；在正常机体环境下，自噬形成的抑制是由抑制细胞凋亡蛋白Bcl-2家族与Beclin1结合诱导的［8-9］，而在其他压力下，Beclin1可脱离Bcl-2的束缚释放后，发挥自噬功能［10］。现有研究证实，内源性大麻素（主要成分为：花生四烯酸乙醇胺（Anandamide，AEA））能通过抗氧化，抑制自由基形成、减少细胞钙内流、抗炎作用和神经细胞发育调节等机制发挥神经保护作用。但其存在多种局限性，如作用广泛，副作用较多，靶器官浓度较低等，较难维持基本活性［11］。因此，基于AEA化学结构，实验室对其进行结构改造，自主合成其类似物N-亚油酰酪氨酸（N-iminoylTyrosine，NITyr），再因目前无此类化合物用于神经退行性疾病的的研究报道，所以，探究其是否诱导氧化损伤的细胞自噬从而抗氧化，对研究与AD的关系具有重要价值。材料1.1PC12细胞大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤（ratpheochromocytoma,PC12）细胞，购自中国科学院上海细胞库。试剂试剂名称生产厂家高糖型DMEM培养液Hyclone公司胰蛋白酶溶液Hyclone公司磷酸盐缓冲液（PBS）Hyclone公司胎牛血清（FBS）北京全式金生物公司青链霉素混合溶液BCA蛋白定量试剂盒过氧化氢（H2O2）TritonX-100牛血清白蛋白（BSA）Tris、吐温-20甘氨酸（Glycine）丙烯酰胺北京全式金生物公司北京全式金生物公司成都金山化学试剂有限公司德国BioFroxx公司德国BioFroxx公司德国BioFroxx公司德国BioFroxx公司上海阿拉丁生物科技公司多聚甲醛甲叉双丙烯酰胺成都市科龙化工试剂厂成都市科龙化工试剂厂过硫酸铵（APS）十二烷基硫酸钠（SDS）四甲基乙二胺（TEMED）DAPI蛋白酶抑制剂RIPA裂解液广谱彩虹预染蛋白markerPVDF膜化学发光底物Beclin1、LC3、ATG5、CB1兔单克隆一抗GAPDH兔多克隆抗体CB2兔单克隆抗体BCL-2、ATG13兔单克隆一抗AlexaFluor594标记的山羊抗兔二抗HRP标记的山羊抗鼠/兔二抗CB1抑制剂AM251CB2抑制剂AM630噻唑蓝粉末（MTT）盖玻片、载玻片成都市科龙化工试剂厂成都市科龙化工试剂厂Bioworld公司上海碧云天生物研究所上海碧云天生物研究所上海碧云天生物研究所北京康为世纪生物科技美国Millipore公司美国Millipore公司美国proteintech公司美国proteintech公司美国caymanchemical公司成都正能生物公司美国Abways公司美国Abways公司美国Selleckchemical美国Sigma公司上海源叶江苏世泰公司仪器仪器名称生产厂家超净工作台美国ThermoFisherScientific公司CO2培养箱台式冷冻离心机Kdc-40低速离心机流式细胞仪6/96孔细胞培养板电子天平BX63正置荧光显微镜酶标仪Westernblot电泳仪、转膜仪ChemiDoc化学发光凝胶成像仪美国ThermoFisherScientific公司美国ThermoFisherScientific公司中国中佳公司中国艾森公司中国NEST赛多利斯科学仪器（北京）有限公司日本Olympus公司美国BioTek公司美国Bio-Rad公司美国Bio-Rad公司步骤2.1细胞的培养及实验分组PC12细胞用含10%胎牛血清的高糖型DMEM培养基培养，培养于37℃、5%CO2的CO2培养箱中，观察细胞生长状态进行后续实验。实验分组如下：①control组（DMEM培养基）；②氧化损伤模型组（500μMH2O2）；③0.5μMNITyr+氧化损伤组；④1μMNITyr+氧化损伤组；⑤5μMNITyr+氧化损伤组。2.2细胞计数（1）倒掉已培养PC12细胞两天的培养基，用1XPBS摇洗2-3次，倒尽残余液体，1mL移液枪加入1mL胰酶对细胞进行消化1-2min后，5mL移液枪加入2mL含5%FBS的培养基，吹落贴壁的细胞使其全部悬浮；（2）吸出细胞悬液至15mL离心管中；放入离心机离心，离心完毕后，倒掉离心后的液体，重新加入1mL含10%FBS的培养基，吹打混匀；96孔板单孔加入180μLPBS，取20μL细胞悬液与PBS混合，采用Quanteen流式细胞仪计数。2.3免疫荧光2.3.1细胞种板细胞铺板前12h用75%乙醇浸泡22*22mm盖玻片，试验时，将洁净且干燥的盖玻片置于六孔板中，调整细胞密度为20*104/mL后，1mL移液枪吸取1mL至每孔内，摇动六孔板，使细胞悬液均匀覆盖整个孔，避免细胞贴壁后分布不均匀，CO2培养箱培养24h；1mL移液枪贴壁吸出培养PC12细胞24h后的培养基，再加1mLPBS摇洗细胞2次，加入提前配好的药，1mL/孔,细胞继续培养24h。2.3.2一抗及一抗前处理（1）1mL移液枪贴壁吸出六孔板中上悬液后，加入PBS浸洗细胞3次*3min；（2）每孔加入1mL4%的多聚甲醛，15min后吸出，加入PBS浸洗细胞3次*3min；（3）每孔加入1mL提前配好的0.5%TritonX-100(1XPBS配制)，室温下静置20min，目的是使细胞膜通透；吸出通透液，每孔加入1mLPBS，吸取残留TritonX-100，重复浸洗3次*3min；（4）用不易掉纸屑的干净滤纸吸干板中残留PBS，每孔轻滴加1mL5%BSA（1XTBST配制），轻摇晃培养板以均匀分布，室温下静置封闭30min；（5）回收封闭液5%BSA，干净滤纸吸干残余封闭液，每孔轻滴加600μL稀释好的一抗（含1%BSA的TBST配制，稀释比例Beclin1、LC3、BCL-2、ATG5为1:600，ATG13为1:500）在盖玻片上，确保每一处细胞都能接触到一抗，4℃冰箱静置孵育过夜。2.3.3孵育二抗及荧光拍照（1）1mL移液枪充分吸出一抗，并做好回收，每孔加入1mL1XTBST浸洗爬片3次，3min/次，干净滤纸吸干孔中残余液体后，六孔板水平放置，盖玻片上轻滴加稀释好的AlexaFluor594标记的二抗（含1%BSA的TBST配制，稀释比例1:1000），室温避光（20-37℃）静置孵育1h，回收二抗，TBST浸洗爬片3次，5min/次；（2）复染核：滴加提前配好的DAPI染液（1μg/mL,RO水配制）避光静置孵育5min，TBST5min*4次洗去残留的DAPI染液；（3）盖玻片（有细胞面向上）放于洗净且干燥的载玻片上，采用BX63正置荧光显微镜观察好细胞图像后，采集图像，在10倍、20倍、40倍物镜下均采集图像。2.4免疫印迹（Westernblot）2.4.1细胞铺板培养方式和加药分组同2.3.1，仅调整细胞铺板密度为100*104/mL。2.4.2细胞蛋白的提取给药处理完毕后，PBS浸洗细胞3次*3min，单孔加入200μL已配好的裂解液，轻摇六孔板，六孔板静置于冰上裂解细胞20min，利用刮刀刮下贴壁细胞，200μL移液枪吸出孔中全部液体至1.5mLEP管中，冰上继续裂解10min。将样品置于提前预冷为4℃的台式冷冻离心机中，配平放置，设置离心参数离心力12000g，离心时间20min后离心；完毕后，轻拿轻放样品，以避免已沉淀的细胞碎片混在蛋白中，吸取离心后的上清液至相应1.5mLEP管中（后续步骤均在冰上操作），按照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行标准曲线的绘制，以及样品的定量，使所有样品满足60μg/20μL的上样量，用于检测。2.4.3Westernblot实验的制胶（1）配制不同浓度分离胶（BCL-2、Beclin1和LC3采用12%分离胶，ATG5和ATG13采用8%分离胶），30%丙烯酰胺、10%SDS、1.5MTris-HClPH8.8、RO水混匀后，再依次加入10%的过硫酸铵和TEMED,混匀。（2）5mL移液枪加入分离胶到玻板四分之三处，立即加入适量异丙醇压胶，待胶在室温下凝固后，倒掉异丙醇，用RO水冲洗残留异丙醇3次，再尽量晾干RO水。（3）5%浓缩胶的制备：根据薄板胶的个数确定试剂体积，30%丙烯酰胺、1MTris-HClPH6.8、10%SDS、RO水混匀后，加入10%的过硫酸铵和TEMED，混匀。（4）1mL移液枪加入浓缩胶，立即插入梳子，待浓缩胶凝固，过程中切忌产生气泡。2.4.4SDS电泳缓冲液的配制电子天平称量Tris7.55g、Glycine47.0g、SDS2.5g，量取400mLRO水溶解后，再定容至500mL的5X电泳缓冲液。用前稀释至1X后即可使用。2.4.5电泳与切胶转模2μLMarker和20μL提取的蛋白，按顺序加入孔后；安装电泳仪，先用80V的恒压电泳，等到蛋白及marker到达分离胶时，然后换成120V的电压，等样品中溴酚蓝电泳至距离玻板底部约1cm处时，结束电泳。以Marker蛋白条带为准，切下对应分子量大小的目的条带，剪裁比胶稍大的PVDF膜（用前甲醇活化1min），安装膜转仪，注意膜与胶之间不能有气泡，且安装顺序要正确，转膜槽中放入冰袋，加入转膜液使其刚好浸没转膜夹，调节电流为250mA，转膜90min。2.4.6封闭孵育盒中加入能浸没PVDF膜的5%BSA封闭液（1XTBST配制），将含蛋白面的PVDF膜向下放置后，将孵育盒置于37℃恒温摇床上封闭1h。封闭完成后将含蛋白面的PVDF膜向上放置（后续操作均向上），回收5%BSA，用1XTBST摇床上摇洗3次*5min，移液枪吸干残余液体。2.4.7一抗孵育将相应目的蛋白和GAPDH的PVDF膜置于已稀释好的相应一抗（含1%BSA的TBST稀释，稀释比例1:1000）中，4℃摇床上孵育19-20h，做好一抗的回收后，用1XTBST摇洗15min。2.4.8二抗孵育加入与一抗对应来源的HRP标记的二抗（含1%BSA的TBST稀释，稀释比例1：10000），室温下摇床孵育1h，吸出二抗，并做好回收标记回收，用1XTBST摇床上摇洗PVDF膜3次*5min。2.4.9凝胶成像PVDF膜上滴加适量已配制好的化学发光底物（A液：B液=1:1），采用化学发光凝胶成像仪（美国BioRad公司）曝光成像。2.5PC12细胞存活率的检测（MTT法）96孔板中接种密度为5*104/100μL的PC12细胞，37℃、含5%CO2培养箱培养24h；按下列实验分组给药处理细胞24h：①control组；②模型组；③1μMNITyr+500μMH2O2组；④3μMAM251+1μMNITyr+500μMH2O2组；⑤3μMAM251+500μMH2O2组；⑥3μMAM630+1μMNITyr+500μMH2O2组；⑦3μMAM630+500μMH2O2组；给药处理后，每孔加入10μL已配好的MTT，在37℃，孵育6h，完成后吸出每孔液体，弃去。再向每孔加入100μL的DMSO，立即用振荡器振荡10min，采用酶标仪（490和560nm）测定吸光度（OD），按细胞存活率(%)=实验组OD值/control组OD值*100%计算。2.6数据处理所得数据均用mean±SD表示。组间比较采用ANOVA分析，组间两两比较采用Dunnett’sT3检测。P<0.05为显著性差异，P<0.01为非常显著性差异，P<0.001为极显著性差异。统计学分析使用GrapdPrism5.0软件。结果3.1CB2受体拮抗剂AM630逆转NITyr的作用如图1如示，与control组相比，H2O2组能明显降低PC12细胞活力，具有显著性差异（P<0.01），1μMNITyr能逆转上述现象。CB1受体拮抗剂AM251不能逆转NITyr作用，无显著性差异，而CB2受体拮抗剂AM630能逆转NITyr的作用，具有显著性差异（P<0.05）。图1NITyr,AM251和AM630对细胞活力的作用*：P<0.05，**：P<0.01vsH2O2,#：P<0.05vsNITyr.3.2NITyr对PC12细胞CB1和CB2蛋白的作用如图2所示，与control组相比，H2O2组能明显降低CB1的蛋白表达，具有非常显著性差异（P<0.01）；与H2O2组比较，NITyr不能上调PC12细胞CB1蛋白的表达，无显著性差异。与control组相比，H2O2组能明显使CB2蛋白表达上调，具有显著性差异（P<0.01）；与H2O2组比较，NITyr能下调PC12细胞CB2的蛋白表达，具有显著性差异（P<0.05）。图2NITyr对细胞CB1和CB2蛋白表达的作用*：P<0.05，**：P<0.01vsH2O23.3NITyr对PC12细胞自噬蛋白ATG5、BCL-2的作用如图3所示，与control组相比，H2O2组能明显降低ATG5和BCL-2的表达，具有显著性差异（P<0.01）；与H2O2组比较，NITyr(浓度为1μM和5μM)可上调PC12细胞自噬蛋白ATG5、BCL-2的表达水平，具有显著性差异（P<0.05），0.5μM浓度下无作用。通过免疫荧光实验发现，与control组比较，H2O2组蓝光弱即细胞数量少，细胞核皱缩，红光弱即ATG5和BCL-2蛋白表达减少，1和5μM的NITyr能逆转上述现象。（图3A-E）。ABCDE图3NITyr对H2O2损伤的PC12细胞自噬蛋白ATG5和BCL-2表达的影响.采用Westernblot(A-C)和免疫荧光法检测细胞ATG5和BCL-2（红色）表达水平，细胞核（蓝色）采用DAPI染液染色（D-E）。（A）：免疫印迹法检测得到的ATG5和BCL-2的表达水平。GAPDH用作内参抗体。（BandC）：TheintensityofATG5(B)andBCL-2(C).*：P<0.05，**：P<0.01vsH2O2.3.4NITyr对PC12细胞自噬蛋白Beclin1、LC3和ATG13表达的影响经Westernblot和免疫荧光法检测结果显示，与control组比较，H2O2组能明显降低Beclin-1和ATG13的蛋白水平，具有显著性差异（P<0.01，P<0.001）。在1μM和5μM的NITyr的保护下，与H2O2组比较，Beclin1蛋白表达上调，具有显著性差异（P<0.05）（图4B，图5A）。自噬蛋白LC3如图4C、图5B结果显示,与control组相比，模型组LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值有下降趋势，但无显著性差异，提示H2O2未对PC12细胞LC3蛋白表达有明显影响，与H2O2组比较，0.5μMNITyr组LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值减小，具有显著性差异（P<0.05），1μMNITyr和5μMNITyr组LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值进一步减少，LC3-Ⅱ表达明显上调，具有显著性差异（P<0.01）,提示暴露于H2O2损伤下的PC12细胞在给予NITyr保护后，NITyr可诱导细胞自噬。自噬蛋白ATG13如图4D、图5C结果显示，与control组比较，H2O2组能明显降低ATG13的表达，具有显著性差异（P<0.001），与H2O2组比较，0.5μM和1μMNITyr可上调ATG13蛋白表达水平，具有显著性差异（P<0.05，P<0.01），0.5μMNITyr无此作用。通过免疫荧光实验发现，与control组比较，H2O2组蓝光弱即细胞数量少，细胞核皱缩，红光弱即Beclin1、LC3和ATG13蛋白表达减少，1和5μM的NITyr能逆转上述现象。以上结果表明，NITyr可诱导H2O2损伤的PC12细胞自噬，从而抗氧化损伤。ABCD图4NITyr对H2O2损伤的PC12细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3及ATG13的影响实验分为5组，分别为：control组：DMEM培养基；H2O2组：细胞在含500μMH2O2的培养基中培养；NITyr+H2O2组：细胞在含三种浓度（0.5μM、1μM、5μM）的NITyr和500μMH2O2的培养基中培养；采用Westernblot法检测Beclin1、LC3和ATG13蛋白的表达(A-D).（A）：ThelevelsofBeclin1,LC3andATG13weredeterminedbywesternblottinganalysis.GAPDH用作内参抗体。（B,CandD）：TheintensityofBeclin1(B),LC3(C)andATG13(D).*：P<0.05，**：P<0.01vsH2O2.ABC图5NITyr对H2O2损伤的PC12细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3及ATG13的影响采用免疫荧光法检测细胞Beclin1、LC3和ATG13（红色）表达水平，细胞核（蓝色）采用DAPI染液染色（A-C）。讨论AEA具有较好的抗氧化作用，但是半衰期短，不利于应用，因此基于AEA的结构，合成了AEA类似物NITyr，而目前国内外尚未有NITyr的抗氧化研究，故本课题以H202建立氧化损伤模型，以研究NITyr是否有抗氧化作用，及其抗氧化的作用机制。目前常用抗氧化的模型法主要有化学法、动物模型法和细胞模型法，其中细胞模型法既能准确模拟体内环境，又能研究体内外物质对细胞氧化损伤的效果和机制，故优胜于化学法的专属性差，动物模型法的试验周期长、成本高［1］。基于文献报道有六味地黄丸［12］、川芎嗪［13］和桔梗多糖［14］等研究了H2O2可诱导PC12细胞氧化损伤，故本课题建立了H2O2氧化损伤模型,探讨了NITyr对H2O2引起的细胞损伤的作用。本研究利用H2O2刺激PC12细胞建立模型，发现NITyr在1μM即能提高细胞活力，同时加入大麻素受体1的拮抗剂AM251不能逆转NITyr作用，而用大麻素受体2拮抗剂AM630能逆转上述作用。表明NITyr可能通过CB2受体达到抗氧化作用。CB1受体主要分布于脑、脊髓和外周神经系统，主要参与记忆、认知和运动控制的调节。而CB2受体主要分布在外周系统，且主要来源于免疫细胞主要参与调节免疫作用。但，近年来也发现CB2受体参与中枢神经系统功能的调控。其中内源性大麻素的生物活性如抗氧化、抗炎、神经细胞发育调节的发生，研究证实是其结合和激活内源性大麻素受体，从而调节情绪、记忆、自主神经活动等。以上实验表明，NITyr有可能是与CB2受体结合或者激动CB2受体达到抗氧化作用，是否直接激动在以后实验中进一步开展。阿尔兹海默症，早期多认为其诱因是基于胆碱能神经假说，而目前更多人更倾向于神经元有毒物质积聚如Aβ大量积聚，Tau过度磷酸化、自噬异常或不足是其诱因［15］。自噬的形成包含诱导、囊泡的核化和延伸、及自噬体形成三大阶段［16］，受mTOR调控的自噬过程，在其mTOR被抑制时，可上调自噬标记因子如Beclin1、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、ATG5/7等诱导自噬［15］，目前在AD患者发现mTOR被抑制对改善AD症状有一定作用［17］。在囊泡核化和延伸阶段亦需要ATG5/7和LC3蛋白的参与。自噬形成时，胞浆型LC3被酶切形成细胞质LC3-Ⅰ，发生泛素样反应，转变为自噬体膜型LC3-Ⅱ,所以自噬水平的高低可由LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ的比值大小来估计。经Westernblot实验发现小剂量NITyr处理H2O2损伤的PC12细胞后，LC3-I/LC3-II的比值有减小的趋势，LC3-1的蛋白表达减少而LC3-II蛋白表达增加，但无显著性差异，表明机体为了清除活性氧自噬增加，但是增加的自噬还不足以抵御氧化应激引起的损伤。加入稍大剂量NITyr后能明显进一步减小LC3-I/LC3-II的比值，表明NITyr能引起自噬增强达到保护细胞的作用。同时研究发现，Beclin1、Bcl-2、ATG5和ATG13的蛋白表达水平在NITyr的作用下显著增加，提示NITyr可能经mTOR介导细胞自噬，对PC12细胞起抗氧化作用。结论以上研究结果表明，NITyr能通过CB2受体抑制H2O2引起的PC12细胞氧化损伤，此过程可能与增强自噬过程有关，提示NITyr诱导细胞自噬可能在抗氧化损伤中有一定的研究价值。参考文献[1]何方婷,陈嘉熠,徐佳伊等.氧化应激细胞模型建立的研究进展[J].食品工业科技,2019,40(07):341-345.[2]MazureNM,JacquesPouysségur.Hypoxia-inducedautophagy:celldeathorcellsurvival?[J].CurrentOpinioninCellBiology,2010,22(2):177-180.[3]郑祖国,张评浒.细胞自噬形成机制及其功能研究进展[J].中国细胞生物学学报,2016,38(12):1541-1548.[4]BaekKH,ParkJ,ShinI.Autophagy-regulatingsmallmoleculesandtheirtherapeuticapplications[J].ChemicalSocietyReviews,2012,41(8):3245.[5]CuervoAM,BergaminiE,BrunkUT,etal.AutophagyandAging:TheImportanceofMaintaining"Clean"Cells[J].Autophagy,2005,1(3):131-140.[6]国海东,国海光,邵水金.自噬在阿尔茨海默病中的作用及其机制[J].生理科学进展,2011,42(05):398-401.[7]许国平,杨鹏,祁宏.Bcl-2蛋白家族调节凋亡和自噬信号通路的研究进展[J].中国细胞生物学学报,2019,41(03):1-6.[8]PattingreS,TassaA,QuX,etal.Bcl-2AntiapoptoticProteinsInhibitBeclin1-DependentAutophagy[J].Cell,2005,122(6):0-939.[9]ObersteinA,JeffreyPD,ShiY.CrystalStructureoftheBcl-XL-Beclin1PeptideComplex:BECLIN1ISANOVELBH3-ONLYPROTEIN[J].JournalofBiologicalChemistry,2007,282(17):13123-13132.[10]LevineB,SinhaSC,KroemerG.Bcl-2familymembers:Dualregulatorsofapoptosisandautophagy[J].Autophagy,2008,4(5):600-606.[11]DeutschDG,GlaserST,HowellJM,etal.Thecellularuptakeofanandamideiscoupledtoitsbreakdownbyfatty-acidamidehydrolase[J].JBiolChem,2001,276(10):6967-6973.[12]高海宁.六味地黄丸对H2O2诱导PC12细胞凋亡影响的研究[D].辽宁中医药大学,2016：5.[13]林文新,马阮昕,冯真英.川芎嗪对过氧化氢诱导PC12细胞氧化应激的作用[J].江西中医药,2018,49(02):29-31.[14]顾程远,陈秋利,李海涛.桔梗多糖对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用及机制研究[J].南京中医药大学学报,2017,33(03):268-272.[15]谭成勇,田慧珍,况煌等.药物调节自噬治疗阿尔茨海默病[J/OL].药学学报:1-7[2019-05-25]./10.16438/j.0513-4870.2018-1107.[16]ChenY,KlionskyDJ.Theregulationofautophagy-unansweredquestions[J].JournalofCellScience,2011,124(2):161-170.[17]Heras-SandovalD,Pérez-Rojas,JazminM,Hernández-Damián,Jacqueline,etal.TheroleofPI3K/AKT/mTORpathwayinthemodulationofautophagyandtheclearanceofproteinaggregatesinneurodegeneration[J].CellularSignalling,2014,26(12):2694-2701.[18]贾济.神经元还原稳态减轻氧化应激损伤的新机制[D].第四军医大学,2015.[19