棉花ghzfp1锌指蛋白基因的克隆及功能分析

棉花ghzfp1锌指蛋白基因的克隆及功能分析

钙指蛋白是生物中广泛存在的一个蛋白质家族。20多年来，人们对磷指蛋白的结构和功能进行了大量研究，并证明了磷指蛋白参与了整个生物体生长发育的过程。目前发现的锡指蛋白有10多种，包括c1h2、2ch、c1c2、c3c、c3h4和lcc。其中，lcc-锌指蛋白包含三个半胱氨酸和一个由氨基酸组成的锌指结构。到目前为止，已经在字母、植物、动物和人类中找到了这种锌指序列的存在，但对这种蛋白质的研究相对较少。根据最近的研究，预计南海棠的糖指数蛋白pei1、hu1和fes1参与了作物胚胎的形成、花的发育规则以及南海棠冬生动物特征的形成过程。甘露醇等。根据研究，由于第一阶段转移水稻的过度迁移，如gassypiumcinos基因的过渡性和抗病性得到了显著改善，但具体的作用机制尚不清楚。在本研究中，我们使用了祖母双杂交技术来分离和确定与ghsfp1（gossypiumbirrutan）相互作用的蛋白质，这为阐明戈斯提蛋白在植物抗逆性中的抗逆性机制提供了重要线索。1材料和方法1.1实验载体和试剂棉花(Gossypiumhirsutum)为中棉所19号,由中国农业科学院棉花所提供.本生烟(Nicotianabenthamiana)为本实验室保存.大肠杆菌DH5α、农杆菌GV3101、载体pBI-GhZFP1、HAP-5-pSPYCE-35S、pSPYNE-35S、pSPYCE-35S、bZIP63-pSPYNE-35S和bZIP63-pSPYCE-35S为本实验室保存,克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司,诱饵表达载体pGBKT7、pGADT7、酵母菌株AH109、Y187购自Clontech公司.酵母双杂交试剂盒BDMatchmakerTMLibraryConstruction&ScreeningKits、酵母培养和转化试剂购自Clontech公司.mRNA分离试剂盒购自Qiagen公司.酵母质粒提取试剂盒(DP112-02)购自TIANGEN公司.DNA重组所用各种酶、DNAmarker、胶回收纯化试剂盒、LB培养基胰化蛋白胨和酵母提取物购自TaKaRa公司,引物合成和测序由上海生物工程公司完成.1.2ctcgt-ccac以质粒pBI-GhZFP1为模板,设计一系列特异性引物.引物1:GAATTCATGACCACTGTTTATGACCC;引物2:CTGCAGCATCAAGAGCTCATTAAC-CCAC;引物3:CTGCAGCCTTGGTGTTCTTTGCTGGTGT;引物4:GAATTCAAGAACTATAACCATTGCT-GC;引物5:CTGCAGCTACATCAAGAGCTCATTA-AC;分别用引物1-2,1-3,4-5进行编码GhZFP1全长、N端1-237氨基酸区域(m1)及C端238-339氨基酸区域(m2)的PCR扩增,连到pMD18-T克隆载体,再用EcoRⅠ和PstⅠ酶切位点进行酶切,定向亚克隆到酵母载体pGBKT7中,经酶切和测序验证.1.3分离培养4个知识品种的半乳糖苷酶活性检测采用LiAc转化法分别将载体pGBKT7-Lam,pGBKT7-53,pGBKT7-GhZFP1,pGBKT7-m1,pGBKT7-m2及空载体pGBKT7转化酵母菌Y187和AH109.将转化的菌体分别涂布相应SD/-His/Trp/X-α-Gal或SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal平板,30℃培养1周,观察菌落生长情况,对其进行β-半乳糖苷酶活性检测.将转化pGBKT7-m1和空载体pGBKT7酵母细胞分别在SD/-Trp/Kan(20μg/ml)液体培养基中培养16-24h,测定培养液的A600,进行诱饵蛋白的毒性检测.1.4菌株的筛选和序列分析按CLONTECH公司酵母双杂交操作手册进行.首先构建盐胁迫诱导棉花叶片cDNA文库,之后将其转化到酵母菌Y187,再将pGBKT7-m1重组质粒转化到酵母菌AH109,利用Mating法筛选与GhZFP1相互作用蛋白质,并按照操作要求测定杂交效率和杂交克隆数以确保筛选文库规模.之后将生长的转化子进行1轮SD/-Leu/-Trp/-His培养皿和2轮SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal培养皿筛选,再挑取生长良好、深蓝色克隆提取酵母质粒并转化大肠杆菌DH5α.然后采用菌落PCR方法进行初筛,再用酶切方法排除相同克隆.将筛选出的每个cDNA融合质粒分别与pGBKT7-m1共转化入酵母AH109株进行回转验证,最后选取呈现明显蓝色的阳性克隆质粒用T7引物直接进行核苷酸序列测定,利用GenBank的数据库资源,用BLAST进行序列分析.1.5速度型pp-5和bcip33s的检测双分子荧光检测参考Walter等方法进行.将GhZFP1的N端m1和GZIRD19A去掉终止子的cDNA片段分别克隆到pSPYNE-35S和pSPYCE-35S载体.以HAP-5-pSPYCE-35S、pSPYCE-35S载体作为阴性对照,以bZIP63-pSPYNE-35S和bZIP63-pSPYCE-35S载体作为阳性对照,分别将这些载体转入农杆菌GV3101,再侵染一月龄本生烟叶片背面,隔2～3d后取下表皮观察荧光.2结果2.1诱变剂的筛选棉花CCCH型锌指蛋白GhZFP1全长339个氨基酸,为分离与其相互作用的蛋白.将其全长基因、N端1-237氨基酸区域(m1)及C端238-339氨基酸区域(m2)的DNA片段分别用特异性引物扩增(Fig.1),并克隆到pGBKT7载体上,命名为pGBKT7-GhZFP1、pGBKT7-m1和pGBKT7-m2.限制性内切酶和测序分析表明,构建的3种诱饵载体正确.2.2pgbkt7-m1和pgbkt7-m1对酵母双杂交的影响将诱饵蛋白载体pGBKT7-GhZFP1,pGBKT7-m1,pGBKT7-m2及空载体pGBKT7分别转化AH109酵母菌,涂布SD/-His/Trp/X-α-Gal或SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal培养板,培养1周.结果发现,含pGBKT7-GhZFP1和pGBKT7-m2载体的转化子在培养板上生长良好,并且在很短的时间内变为蓝色,而含pGBKT7-m1及空载体pGBKT7的转化子不能生长(Fig.2,见第427页,彩版),表明pGBKT7-m1在该酵母双杂交系统中无自身激活作用,可以用于文库筛选.再将转化pGBKT7-m1和pGBKT7载体的酵母菌分别在SD/-Trp/Kan液体培养基中培养过夜,观察发现pGBKT7-m1转化菌株生长良好,与pGBKT7转化菌株生长速度无明显差异.二者A600比较接近且都大于0.8,说明诱饵载体pGBKT7-m1对酵母细胞没有毒性,可以直接用于酵母双杂交文库筛选.2.3阳性克隆的获得、分析和分子鉴定以pGBKT7-m1载体为诱饵蛋白,采用酵母共转化方法筛选盐诱导棉花幼苗叶片cDNA文库,共筛选了6×106个克隆.将转化子经1轮SD/-Leu/-Trp/-His培养板和2轮SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal培养板筛选,再进行β-半乳糖苷酶活性测定,获得64个阳性克隆.之后用菌落PCR方法进行初筛(Fig.3).将获得阳性克隆提取质粒,再利用酶切方法进行鉴定,得到25个阳性克隆(Fig.4).将筛选出的每个cDNA融合质粒分别与pGBKT7-m1共转化入酵母AH109菌株进行回转验证,以进一步排除假阳性克隆.最后选取呈现明显蓝色的阳性克隆质粒进行核苷酸序列测定,通过测序分析及与GenBank数据库进行同源性比较,合并序列完全相同的克隆,并剔除载体的阅读框与目的基因不同的克隆,获得9个不同类别的基因(Table1).这些基因分别为RING-type锌指蛋白、RISP、RD21A、β-淀粉酶、RD19A等基因在棉花中的同源性基因,分别参与了泛素化、电子传递、蛋白代谢等过程.通过分析这些靶蛋白的已知功能,为研究GhZFP1锌指蛋白的未知生物学功能提供重要信息.并且这是首次在棉花中获得这些靶蛋白基因序列,目前尚未有相关的研究报道.2.4对烟草细胞的荧光检测为进一步验证GhZFP1与靶蛋白Y9(GhZFP1interactingandresponsivetodehydrationprotein19A,命名为GZIRD19A)的相互作用,将GhZFP1的N端区域m1与黄色荧光蛋白的N末端融合,GZIRD19A与黄色荧光蛋白的C末端融合,分别将融合载体、阳性和阴性对照载体,连同沉默抑制子P19共侵染本生烟.结果发现,共转化m1-pSPYNE-35S和GZIRD19A-pSPYCE-35S载体的烟草细胞核和细胞质中均检测到荧光,说明GhZFP1和GZIRD19A在细胞核和细胞质中都能相互作用.而转化阳性对照载体bZIP63-pSPYNE-35S和bZIP63-pSPYCE-35S的烟草细胞,只在细胞核中检测到荧光;转化阴性对照载体HAP-5-pSPYCE-35S和空载体的烟草细胞中没有检测到荧光(Fig.5,见第427页,彩版).3ghsfp1分子机制的初步探索GhZFP1是我们首次从棉花中分离的一种CCCH型锌指蛋白.初步研究表明,过量表达该基因的转基因植物耐盐性和抗病性都有显著提高,说明GhZFP1蛋白在提高植物抗逆性方面发挥了重要作用.但作为一种新发现的蛋白,其提高植物耐性的具体分子机制和其它方面的生物学功能还不清楚.酵母双杂交技术是研究蛋白质间相互作用的有效分子生物学方法,在分析新基因的生物学功能和发现新的作用蛋白质方面有着广泛应用[10～12].在本研究中,我们成功地利用酵母双杂交系统筛选到了与GhZFP1蛋白相互作用的9个靶蛋白,通过对这些靶蛋白的分析,不仅对GhZFP1提高植物抗逆性的分子机理有所了解,还为探索GhZFP1蛋白的未知生物学功能提供了新线索..由此推测,GhZFP1可能通过与半胱氨酸蛋白酶的直接作用在调控植物抗逆性方面发挥了重要作用.这一发现为揭示GhZFP1蛋白提高转基因植株抗逆性的分子机理提供了重要信息.此外,靶蛋白Y6与植物病程相关蛋白家族的类甜味蛋白基因PR5同源性也高达61.2%.而前人研究结果显示,PR5类蛋白可能通过与质膜的特异作用造成膜穿孔,诱导了真菌细胞膜的渗漏,从而参与植物对真菌的诱导响应过程.本研究结果揭示该类蛋白与GhZFP1蛋白存在相互作用.尽管PR5类蛋白确切的生物学功能尚不清楚,两者之间具体的分子调控机制也有待研究,但这一发现至少为探索GhZFP1和PR5类蛋白的未知生物学功能提供了重要线索.近年来的研究表明,锌指之间可以互相作用,锌指蛋白之间或与其它蛋白之间可以相互影响.Mackay等研究了不同锌指的相互作用,发现GATA-1在CCCC区域与它自身、在锌指1(F1)区域与Fog锌指、在F1或F2区域与EKLF、在F1-2区域与RBTN2/LMO2均存在相互作用.本研究筛选到的Y1靶蛋白与拟南芥NP＿176722同源性高达66%,属于RING-type锌指蛋白家族,包含典型的ZnF＿RBZ结构域.大量研究结果表明,RING-type锌指蛋白主要参与泛素化的信号传递过程,通过结合RanGDP和特异泛素-蛋白酶体途径,可以高效并选择性地降解