微藻生物柴油培养的营养及油脂含量研究进展

微藻生物柴油培养的营养及油脂含量研究进展

0微藻生物柴油的发展现状现在，世界能源消耗约为113.05亿km/h。预计在2050年，世界能源需求将再次回到一个水平，并达到216.105亿hh。全球大约80%的能源需求来自于化石燃料,然而由于化石燃料的不可再生性且其大量使用导致了全球气候变暖、环境污染、健康等问题,使寻求可以替代石油在能源结构中占主导地位的可再生清洁能源是目前普遍关注的热点,因此,许多国家正把未来替代能源的注意力转移到清洁、可持续发展的新能源上,在众多的可再生能源中,生物燃料是最有希望在未来替代化石能源并发挥重要作用的可再生能源。生物柴油是最常用的生物燃料之一,被公认为理想的可再生能源,因而也被看做为未来主要的能源来源。生物柴油的主要成分是脂肪酸甲酯(FAME),是以可再生资源(如油菜籽油、大豆油、玉米油、棉籽油、花生油、葵花子油、棕榈油、椰子油、回收烹饪油、动物油以及微生物油脂等)为原料通过酯交换制备而成,具备与石化柴油相近的性能,且具有以下优点:优良的环保特性、良好的燃料性能及可再生性。目前,生物柴油的生产主要是以植物和动物脂肪酸为原料。在美国,生物柴油主要以大豆为原料,其他来源包括棕榈油、菜籽油、动物脂肪酸、玉米油、废食用油和麻疯树油。东南亚一些国家以一些热带植物的种子为原料,如棕榈等制备生物柴油,在日本则主要以废弃食用油做为原料制备生物柴油,然而这些原料存在着价格高、数量不能满足生物柴油大规模稳定发展的问题,而且利用植物油脂制备生物柴油存在着与人争粮、与粮争地的问题,有悖于国家相关政策。微藻是生产生物柴油的良好原料。微藻能利用阳光、水、CO2合成自身所需要的物质。许多微藻含油量极高,在适宜的培养条件下,一些微藻的含油率高达干藻质量的50%~70%,且微藻油脂中的脂肪酸适合生物柴油的制备。藻类还具有光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物产量高的特点。据保守估计,每年每公顷微藻可生产30000~50000L油脂,而富油植物如棕榈和麻风树等每年每公顷的油脂产量仅为1300~2400L。微藻种类繁多,目前已知的种类有300000多种,远远多于陆地植物的种类,不同的藻类能适应不同的生长环境,这也为微藻生物柴油大范围推广提供了保障。早在20世纪70年代西方发达国家就曾基于微藻能源的研究进行过藻种筛选方面的研究,但由于当时能源环境和成本等因素影响,微藻生物柴油并未引起足够的重视。近年来随着能源危机的加剧和全球气候变暖等问题的突显,以美国、英国、日本为代表的各国都致力于微藻的大规模培养和生物柴油的研发,掀起了全球性微藻制生物柴油的浪潮,并有了一定的突破。但目前微藻生物柴油工业化生产仍面临很多问题,比如一些微藻通过转基因在极端苛刻的培养条件下含油率达到干藻质量的80%以上,但放大培养时含油率仍偏低或不易成活;大规模培养时藻密度不够高,培养成本过高不能满足工业化生产等问题。本文综述了前人在微藻高密度、高油脂含量培养方面的方法及取得的成果,并结合油脂的生产率,从经济效益和环境效益方面做简要的分析,提出未来培养微藻制备生物柴油的发展方向。1生物柴油的生产微藻属于低等植物,主要通过光合作用固定二氧化碳合成有机物,采用传统方法培养出的藻细胞密度一般较低,会导致微藻培养易被其他微生物污染、微藻收获比较困难、微藻培养成本偏高等问题,不能满足工业化生产生物柴油的要求。如何提高微藻培养密度是培养微藻制备生物柴油研究的重点之一。微藻的高密度甚至超高密度培养,是使藻细胞密度比普通培养条件下高1~2个数量级(甚至上千倍),更趋近于高等植物组织细胞量,以求达到在生物量相同的情况下,大幅度降低培养体积和设施投资,也更易于操作,大大减少了其他生物的污染几率、压缩了收获设备数量、降低了水电能耗、并尽可能大的节省生产成本和提高产品经济效益。目前对微藻高密度的培养主要是在微藻最优生长条件下通过改变光照、碳源和设计新型反应器来实现的,以下将结合这三方面探讨微藻高密度的研究进展。1.1营养法对微藻培养密度的影响微藻的培养密度根据营养方式的不同而有很大差异,微藻培养的营养方式依据对光源和碳源的需求可分为光自养、异养、混养和光异养四类(如表1)1.1.1微藻自养培养微藻多为光合自养微生物,光自养培养是指微藻利用光作为能量来源,以无机碳化合物为碳源将化学能转化为生物能的营养方式。这是自然界中微藻最常见最原始的营养方式。光自养培养微藻操作简单、易于大规模培养,适宜几乎所有微藻的培养,而且培养成本低,但培养密度也较低(见表1),如MichaelK.Danquah等在户外自养培养微藻,在第12天得到藻的生物量达最大,仅为1.15g/L。微藻培养的营养元素60%以上是碳源,在微藻自养培养时通以CO2可显著提高藻的生物量,如蒋礼玲等利用含15%CO2的烟道气自养培养普通小球藻,同时流加氮源(硝酸钠)提高小球藻的生物量,总生物量为1.235g/L,比先前培养的高1.4倍。光自养培养主要存在以下缺点:藻的生物量偏低,致使资源相对消耗大,且藻细胞密度较低不利于规模培养时藻生物量的收集;光自养培养受到光照因素的限制,光照不足及光分布不均导致的光合效率较低,并不能满足规模培养的需求。1.1.2生物反应器中藻细胞的活性检测异养培养是指微藻仅以有机碳源作为能源和碳源(见表1)。异养培养可消除自养培养时光带来的不利因素,实现高密度培养。Lewin等于1953年首先发现了一些藻类能利用有机物作为唯一碳源和能源进行异养生长。目前对异养培养微藻研究较多的是小球藻,如刘世名等发现连续流加分批异养培养小球藻59h,总糖量为60g/L条件下得藻生物量可达34.1g/L,实现了异养高密度培养;WeiXiong等在5L生物反应器中异养培养Chlorellaprotothecoides,通过改善培养条件补料培养167h后藻生物量达51.2g/L,是自养培养的3倍;闫海等在50L发酵罐中异养培养小球藻的结果显示,通过流加碳、氮源,并对pH值进行控制,可以在2d内获得藻细胞干质量浓度高达40g/L以上的产量;WuZY等对Chlorellapyrenoidosa异养培养,通过改变培养条件,在最佳条件下获得最大的生物量达116.2g/L,是目前异养培养Chlorella获得的最大培养密度。大量研究表明,利用工业发酵系统进行的异养化高细胞密度培养技术培养微藻,可以克服光合自养培养的诸多缺陷,是提高微藻产量与产物产率的有效途径。但是并不是所有的微藻都可以进行异养生长,需要通过异养化筛选,找到能异养生长的微藻。1.1.3化学成分的检测混养又称兼养,是在利用光能和CO2等无机碳源的同时,以有机碳(如葡萄糖、醋酸盐等)作为补充碳源和能源的一种培养方法,是光和有机物的联合作用结果。微藻的混养培养过程包括光能的吸收转化、CO2的吸收固定、有机物的同化等,是比较复杂的生化过程。许多研究表明,微藻异养培养的比生长速率µ大约等于自养和异养培养的总和,如刘晨临等研究发现卡德藻(Tetraselmissp.)混养培养的细胞密度大于自养和异养条件的细胞密度总和,混养的比生长速率是自养的2倍,异养的1.3倍;FengChen等在3.7L的发酵罐中以葡萄糖为碳源通过补料分批混养培养Spimlinaplatensis藻的最大生物量达10.24g/L,是在相同条件下自养培养的5.1倍。同异养培养相似,并不是所以藻都适应混养培养,所以混养培养时藻种也需经过筛选。1.1.4马铃薯可溶性物光异养光异养是光养与异养相结合的一种培养方式,主要是通过有机碳源作为碳源的同时又提供能量来源,使能量的转化尽可能最大化。JaimeFábregas等用马铃薯可溶物光异养培养Tetraselmissuecica得最高藻密度为1.4×106cells/ml,是自养培养的3.9倍。YangJinShui等在2L光生物反应器中光异养培养ChlorellaminutissimaUTEX2341,并就其生物量和油脂含量的增长建立了数学模型,为工业光异养培养微藻提供了分析方法。1.2光生物反应器和密封式光生物反应器金属酶微藻的培养密度受到反应器结构的影响和制约,根据是否密封可把微藻培养的反应器分为开放式光生物反应器和密封式光生物反应器。根据光反应器的结构、培养液的吸收利用、光源的捕获、气液传质等,可细分为多种不同的反应器。1.2.1池塘的类型所谓开放式光生物反应器就是指开放池培养系统(openpondculturesystem)。主要有四种类型:浅水池、循环池、跑道池式、池塘。开放式池塘为藻类培养的最古老,最简单的系统,可实现室外的露天人工制造的培养池或特定环境下的小规模湖泊,其优点是造价低廉、操作简便、生产成本较低,但由于培养环境不稳定、培养条件无法控制,培养效率较低,只能用于螺旋藻、小球藻、盐藻等少数特定微藻的培养。1.2.2对藻细胞密度的高次元规划为实现微藻的高密度培养,从而提高效率、降低生产成本、保证质量,密封式光生物反应器在微藻培养上被广泛应用。密闭式光生物反应器有:管道式、平板式、柱状气升式、柱状鼓泡式、搅拌式发酵罐、浮式薄膜袋等。密封式光生物反应器比开放式光生物反应器更精密,培养条件更容易控制,培养密度也较高。Jose’Moreno等人分别在户外开放池和封闭管式光反应器中通CO2自养培养Anabaenasp.ATCC33047,通过单位体积生产率的比较发现:封闭管式光反应器是开放池培养的4倍(分别为0.4g/(L·d)、0.1g/(L·d));刘建国等用不同类型(平板玻璃和螺旋管道)的光生物反应器,实现了微绿球藻Nannochloropsissalina的高密度培养,细胞密度可以达到(1.2×1011~3.6×1012)细胞/L,该密度比目前生产上培养的密度平均提高了数百倍。近年来,科研工作者通过不断改变反应器结构来提高微藻的培养密度,取得了良好效果,如KamonpanKaewpintong等人设计了两种不同反应器:鼓泡式和气升式反应器并用来培养Haematococcuspluvialis,实现了高密度培养,藻密度分别为42×104cells/mL、79.5×104cells/mL,通过比较发现气升式反应器更适合藻的高密度培养;孙利芹等设计了平板式光生物反应器和柱状气升式内环流光生物反应器培养纤细角毛藻,发现平板式光生物反应器具有高的液体循环速度和相对较小的光衰减程度,更有利于藻体细胞对光的吸收,培养纤细角毛藻时藻培养密度和生长速率分别达到6.98×108cells/mL和1.42g/(L·d),且操作简单、容易放大,适合于微藻的规模化高密度培养;柱状气升式内环流光生物反应器培养效率相对较低,纤细角毛藻的培养密度和生长速率仅为1.52×108cells/mL和0.935g/(L·d),其培养环境稳定、主要培养参数容易控制,可实现无菌化纯培养,在探索微藻生长动力学、优化微藻培养条件和转基因微藻的培养等方面具有优势。与柱状气升式内环流光生物反应器相比,30L平板式光生物反应器具有小光径(10cm)、高A/V比(100)和低L/D(<70ms),具有高的培养效率;此外,该类型的反应器结构简洁、可以随意调节放置角度以便使其获得最佳的取光效果,从而可以克服由于培养后期高的细胞密度造成的光衰减程度增大带来的光合作用效率降低的不足,而且容易放大和加工制造、可以根据需要设计不同的光径、操作条件容易控制、占地面积小,使其在微藻的高密度大规模培养方面具有很大的价值。李元广等在2L封闭式光反应器中连续培养三角褐指藻细胞密度达到10880×104cells/mL,是15L塑料桶的3.5倍;在10L光生物反应器中培养等鞭金藻,第10天浓度达到最大值5280×104cells/mL,是相同条件下分批培养细胞密度357×104cells/mL的14.8倍;在10L光反应器中培养亚心形扁藻,120h细胞密度达1650×104cells/mL,是分批培养最高密度450×104cells/mL的3.67倍,实现了藻的高密度培养。张希庆报道了新研制开发的两种新型密闭式光生物反应器:40L气升式内环流光生物反应器和30L平板式光生物反应器,并成功的应用于海洋微藻的培养,提高了它们的培养密度,使紫球藻生物量产量达到1.5g/L,比一般培养高2.5~3.0倍;螺旋藻的生物量产量达到3.93g/L,也远高于一般培养水平;纤细角毛藻达到5~10亿cells/mL,等鞭金藻的培养密度0.76~1.5亿cells/mL,获得了高于一般培养的2000万cells/mL的培养水平。虽然密封式光生物反应器在微藻的培养上有了很大的发展,但与传统生物反应器及发酵工业相比,光生物反应器的研制开发尚处于初级研究阶段,尤其是其应用研究涉及面较窄,仅局限于少数几种微藻,并且在微藻高密度培养技术方面缺少完整、系统的研究。2高脂肪微藻油含量的培养微藻油脂属于单细胞油脂,其主要组分是甘油和脂肪酸。藻种、营养元素和培养方式都是影响微藻油脂含量的重要因素。2.1藻种含油率的确定不同藻种的油脂含量有很大的不同,表2列出了目前研究较多含油率较高的一些藻种含油率。从表2可以看出,有些微藻的含油率可达干质量的80%左右,所以高油脂含量藻种的筛选也是微藻高油脂含量培养的重要一步。2.2藻细胞脂质和油脂含量普遍认为,氮缺乏会导致微藻油脂的积累,微藻细胞内的脂质含量可由20%~30%增加到60%~70%,YannaLiang等通过对Chlorellavulgaris抑氮培养,藻细胞脂质含量由33%增加到38%。刘志媛等研究了铁对微藻油脂含量的影响,发现加铁使含油量不高的小球藻的脂含量提高了7倍,高达干藻质量的50%以上,这对于生物柴油的开发具有一定的吸引力。除此之外磷、硅等营养元素的含量也会对微藻油脂含量带来一定影响。2.3光自养与异养相结合的培养方式营养方式对微藻含油率的影响主要是自养和异养培养时含油率的变化。YannaLiang等通过改变培养条件在自养时培养Chlorellavulgaris获得较高的含油率(38%);都基峻等发现在自养培养时全天24h光照比12h∶12h更有利于细胞粗脂肪的积累。XiaolingMiao等异养培养Chlorellaprotothecoides取得了良好效果,藻的油脂含量高达55%,是自养时的四倍。由于在自然条件下,自养培养微藻时太阳光只能维持数小时的光合作用,当夜晚来临时细胞进行呼吸作用又大量消耗光合作用产物,降低了生产效率。JamesCOgbonna等第一次提出了光自养与异养相结合的培养模式,来提高藻的含油率,即在晚上通过加有机碳源,实现自养向异养的转变,为了维持第二天异养转变为自养,有机碳源的添加量以在夜晚完全消耗为宜。WeiXiong等通过光养和异养相结合的模式即在光暗循环的暗阶段补加适量有机碳源来培养Chlorellaprotothecoides,在光合作用下固定二氧化碳生长并在异养时积累油脂,最终获得藻的油脂的含量高达69%,这是一种不同于混养的培养方式。混养时,葡萄糖会使叶绿素降解抑制光合作用。这种培养方式分为两个阶段:绿培养阶段(光合作用生长阶段)和黄培养阶段(异养生长积累油脂阶段),比混养效果更显著,因为此举加强了碳的利用效率,为工业规模培养微藻制备生物产油提供了放大模式。3产油率、成本和环境分析3.1基于光生物反应器的培养模式优化从微藻制备生物柴油的角度分析,不论是高密度还是高油脂含量微藻的培养,最终都要回归到产油率上。通过上述分析可知,通过藻种的筛选,异养和混养培养时藻的密度较高;通过设计优化光生物反应器亦可实现藻培养密度的最大化;光养和异养相结合的培养模式藻细胞含油率远高于自养时的含油率,也高于异养时的含油率,且藻的生物量较高。所以通过提高反应器的性能在光养和异养相结合的培养模式下培养微藻可获得最大含油率。3.2其他有机碳源的合成及其应用从培养规模考虑,光自养不适合大规模培养,异养、混养和光异养均可大规模培养,获得较高的培养密度;跑道式反应器建造和控制成本低廉,其培养微藻制备生物柴油的性能已被美国能源部广泛评估,但是由于培养密度较低,会带来一系列的后处理问题,并不是理想的选择。封闭式光生物反应器具有培养密度较高、培养条件易于控制、生产效率高等优点,但反应器设计成本过高、技术上还不够成熟,仍需改进,以便规模培养微藻制备生物柴油。总之,通过改进开放式反应器提高微藻的培养密度,降低封闭式反应器的设计加工和控制成本是微藻培养光反应器设计和研究的两大难点和热点(表3列出了两种不同培养系统下不同反应器培养微藻的优缺点)。培养微藻制备生物柴油的目的是解决石化燃料的不可再生性及其带来的环境问题,所以微藻的培养不能单单定义在高的产油率上,还需综合考虑培养成本、环境等因素。自养培养具有:1)以阳光为能量源,以廉价的自然资源(如CO2和H2O)培养微藻,有助于减少全球CO2气体;2)可以充分利于不能用于农业生产的盐碱地等,以太阳为能源培养微藻,降低培养成本;3)可获得较大的能量产出投入比等优越性。但自养培养的不足之处也是不可忽略的(见表1)。异养加有机碳源能有效提高藻的培养密度和藻的油脂含量,但是考虑到有机碳源(目前微藻培养所添加的有机碳源以葡萄糖、乙醇、醋酸盐等为主)成本较高、能量的产出投入比较小等问题,并不是理想的方法,而且有机碳源的添加会增加染菌的几率。为了降低添加有机碳源所带来的成本问题,YannaLiang等提出了用廉价的粗甘油作为有机碳源成为可能,因为随着生物柴油产量的不断增加,市场上粗甘油产品也将不断增加,粗甘油的价格已由2004年的$0.25/lb降至2006年0.025~0.05/lb;HanXu等用玉米粉水解代替葡萄糖异养培养Chlorellaprotothecoides降低了培养成本,最大藻密度达15.5g/L,油脂含量为46.1%;ChunfangGao等用酶水解甜高粱汁作为碳源替代葡萄糖异养培养Chlorellaprotothecoides,120h的培养后的藻生物量和油脂含量为5.1g/L和52.5%,生物量是加葡萄糖的1.4倍,油脂含量相近;LiangWang等通过稀释养殖废水培养Chlorellasp,随稀释倍数的增加藻含油率从9.00%上升到13.7%,藻类去除废水中氨,总氮,总磷,COD量分别为100%,75.7%~82.5%,62.5%~74.7%和27.4%~38.4%,既降低了培养成本,提高了油脂含量,又具有良好的环境效益;ChanYoo等分别对葡萄藻和栅藻通以10%的CO2和烟道气进行培养,测它们