酵母双杂交系统的遗传学分析

酵母双杂交系统的遗传学分析

蛋白质是生命功能的基础。体内的许多生命活动都依赖于蛋白质-蛋白质和蛋白质-氨基酸之间的相互作用。但由于蛋白质与其他生物大分子间作用依赖于细胞内环境,作用时间及作用力差异极大,因而传统生化方法受到较大限制。新兴起的双杂交系统应用有效的酵母遗传学方法分析蛋白间相互作用,能快速克隆编码与某一蛋白作用的配体蛋白的基因,得到广泛应用,在此基础上相继出现反向双杂交系统、三杂交系统等多种新技术,大大加速了此领域的研究。1转录激活功能酵母双杂交系统,又称蛋白阱捕获系统,是由Fields和Song等人根据真核转录调控的特点创建的。真核生长转录因子含有两个不同的结构域:DNA结合结构域(DNA-bindingdomain,BD)和DNA转录激活结构域(Transcription-activatingdomain,AD)。BD识别DNA上特异序列,并使转录激活结构域定位于所调节基因的上游,AD与转录复合体其他成分作用,从而启动所调节基因的转录。二者连接区在适当部位打开,可使BD与AD分离,而且两结构域可重建转录因子,发挥转录激活作用。将拟研究的靶蛋白(prey)基因与AD序列结合,编码另一蛋白——诱饵蛋白(bait)的基因与DNA的BD序列结合,形成两段融合基因。在构建融合基因时,靶蛋白或诱饵蛋白与结构域基因必须在阅读框架内融合(不破坏各自的密码子)。当这两段融合基因在同一菌株内表达,靶蛋白与诱饵蛋白在核内相互作用时,才能重新形成一个完整的有活性的转录因子,从而激活报告基因的转录。所以报告基因表达与否,即可判断靶蛋白与诱饵蛋白之间是否作用。酵母双杂交系统就是利用融合基因,通过激活报道基因的表达,探测蛋白质-蛋白质的相互作用。目前研究中常用的DNA结合结构域基因有GAL4(1-147);LexA(Ecoli转录抑制因子)的DNA-BD序列,常用的转录激活结构域基因有GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。其中酵母半乳糖酐酶基因的转录因子为GAL蛋白,由881氨基酸组成的GAL4-BD有核定位序列,而GAL-AD没有。因此,在GAL-AD氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T抗原的一段序列作为核定位序列。酵母细胞是酵母双杂交系统的报道株。编码1个蛋白的基因(prey)融合到明确的转录调控因子的DNA-BD(如GAL4-BD),另一个基因(bait)融合到转录激活结构域(如DAL-AD,VP16)。Bait-AD融合基因转录入表达prey-BD融合基因的酵母细胞系中,Bait-prey相互作用,使转录因子重新具有完整的活性,导致相应报道基因的表达,酵母才能在培养基上表现出相应的表型——生长或抑制。2质构分析的特点酵母双杂交系统应用酵母作为报道株,它有许多优点:易于转化,回收扩增质粒;具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因;酵母内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点:1)敏感性主要是由于:①采用高拷贝和强启动子的表达载体,使杂合蛋白表达过量;②激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物,之后又与启动子DNA结合,此三元复合体使杂交蛋白各组分间结合更趋于稳定;③通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大;④检测的结果可以是基因表达产物的累积效应,如酵母表型,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。2)简洁性融合蛋白相互作用后,减去了纯化蛋白质的繁琐步骤。3)真实性检测在活细胞内进行,作用条件与作用力无需模拟,在一定程度上代表细胞内的真实情况。4)广泛性酵母双杂交系统可采用不同组织器官细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库,能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质,适用于部分细胞浆细胞核及膜结合蛋白。以上特点决定了酵母双杂交系统最主要的应用是快速,直接分析已知蛋白之间的相互作用,进而分析其功能结构。如利用这项实验技术,鉴定了信号分子TCF4自身相互作用,在发挥作用过程中形成二聚体,推测其结构花式为HLH或LZ。许多蛋白质之间的相互作用都是用酵母双杂交的方法分析的,如RAPL与RIF1等。利用酵母双杂交系统,也可以通过筛选靶蛋白表达文库,来寻找与分离新的与靶蛋白结合的配体及其编码基因。根据这条技术路线,已寻找到与APCL羧基端相互作用的一种新的蛋白质EB3。该实验技术还可应用于确定两已知有生理作用的蛋白质之间的作用位点或结构域。已报道成功地分析和测定了多种重要结构域。如P85三磷酸肌醇激酶和P110亚单位作用的结构域,蛋白磷酸酶2A(PP2A)新的调节亚基PR48。该技术现已广泛应用于信号传导、蛋白功能研究、癌基因研究和细胞凋亡研究等领域,除上述几方面以外,在绘制蛋白质相互作用图谱,进行药物设计等许多方面也发挥作用。3蛋白质双杂交系统酵母双杂交系统在研究蛋白-蛋白,蛋白-核酸间相互作用方面快速有效,有广泛的应用,但也存在一些局限性。它有两个弊端是不容忽视的:1)“假阳性”是酵母双杂交的一个重要问题。由于某些蛋白质本身具有激活转录功能或在酵母内表达时的转录激活作用,使prey-BD融合基因与bait-AD融合基因表达产物无须特异结合,就能启动转录系统。另外有些蛋白质表面有对其他蛋白质的低亲和力区,容易形成蛋白体复合物,能够引起报告基因表达,使酵母出现相应表型,产生假阳性结果。2)所分析的可能相互作用的蛋白质必须定位于核内,才能激活报告基因,但是很多蛋白质的相互作用依赖于翻译后加工,如二硫键的形成等,而此过程非要在胞浆内完成,这样有多种蛋白质不适用此方法。许多研究者在实践中对酵母双杂交系统进行了改进。针对“假阳性”问题出现了双筛选系统和假阳性显示分析法等。其中双筛选法是指蛋白质相互作用激活两个以上报道基因,只有同时具有两种以上相应表型才是真阳性结果,如Gibcobr1的酵母双杂交系统采用MaV203菌株,该系统共有3个报告基因:HIS3、LacZ和VRA3。当Prey-bait相互作用时,以上报告基因表达,酵母可在缺His平板上生长,使X-gal变蓝,同时由于启动了VRA3系统,将培养其中5FOA转化为5FU,使阳性菌落生长受抑制。多重选择明显提高了筛选率。此外,还可以辅助以抗生素筛选与蓝斑筛选相结合的方法。最近出现的哺乳动物双杂交系统也是利用体内重建转录因子的原理,在基因水平上分析蛋白质-蛋白质相互作用,已成为酵母双杂交系统的辅助手段。该系统与酵母双杂交的区别在于:报道基因与融合基因位于不同的载体;融合蛋白使报道蛋白水平升高,而不是从无到有,它的优点是哺乳动物更好地模拟细胞内环境,较酵母双杂交更为快速,在转染48h内就可得同样的结果。4酵母体学和基因表达调控的作用确定蛋白质之间相互作用后,还要进一步研究其结构和功能的关系,确定蛋白质间作用的关键位点或起决定作用的个别氨基酸,特定结构尤为重要。1996年,VidaliX等人建立了反向酵母双杂交系统,为这一领域的研究提供了有效的途径。这是一项鉴定阻断蛋白间相互作用的技术,其关键是报道基因的表达产物对细胞生长有抑制作用。这样当DNA的BD和AD的融合蛋白相互作用时,表达出有毒性的报道蛋白,细胞不能生长。Uidal等建立的酵母细胞株中,其URA3的表达由含CAL4结合位点的启动子严密控制,此细胞株在缺乏尿嘧啶的培养基中需GSL4的DNA结合结构域和转录激活结构域的融合蛋白相互作用,使URA表达,其产物为合成尿嘧啶所必需,因此细胞能够存活。但此产物同时能催化5-氟乳清酸转化为5-氟尿嘧啶,所以在含5-氟乳清酸的完全培养基中则受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。根据这一原理,可以筛选出阻断蛋白质相互作用的突变体。反向酵母双杂交系统还可作为研究体内功能的遗传学方法。临床上可以筛选阻断蛋白质相互作用的小肽类药物,这也是当前及今后研究的热点之一。基因表达调控的另一重要因素是蛋白质-核酸间相互作用。三杂交系统提供了分析二者作用的新工具。它的基本原理是将一个已知的与RNA结合的蛋白质与BD构建第1个融合蛋白,将待定的RNA结合蛋白质与AD构建第2个融合蛋白质,同时构建一条融合RNA,含