酵母双杂交系统在蛋白质相互作用研究中的应用

酵母双杂交系统在蛋白质相互作用研究中的应用

近年来，stan建立了一种非常有效的蛋白质相互作用研究方法。最重要的特点是，在这种快速生长的、易操作的系统中，可以研究真核细胞的蛋白质相互作用，并通过编码分析获得与未知蛋白质相互作用的序列。随着这一方法的广泛应用，许多未知和重要的蛋白质相互作用被暴露出来。同时，近年来，在现有的双重母生殖器的基础上发展了大量的后代系统：一个混合系统用于研究蛋白质和dna的相互作用；相反的双带系统用于研究、解离或破坏蛋白质相互作用的因素。不同类型的混合系统用于研究蛋白质、茶多酚和小配体之间的相互作用。最新的sos富有化工系统是为了克服现有系统的不足。在本文中，我们介绍了双重分子系统的原理和应用发展。1dna结合功能区和激活转录功能区本世纪80年代末期对真核转录因子的研究为酵母双杂交系统的创立提供了理论基础.研究证实,很多真核基因的表达通常处于本底水平,一旦有转录激活蛋白的诱导则出现高水平表达.这种转录激活蛋白,如酵母的GAL4等都具有两个相互独立的功能——与特异性DNA序列结合的功能和引导RNA聚合酶激活转录的功能.同时更重要的发现是:这两个功能分别由两个独立的功能区域负责.即DNA结合功能区(DNA-bindingdomain,DNA-BD)和激活转录功能区(Activationdomain,AD).前者负责结合上游顺式激活序列(UpstreamActivationSequence,UAS),后者则负责引导RNA聚合酶复合体激活基因转录.DNA-BD和AD对激活转录是必不可少的.理论上,任何一个AD都可以与任何一个DNA-BD结合并激活转录,即杂合的DNA-BD和AD可以组成一个具有功能的转录激活蛋白.不仅如此,只要DNA-BD和AD能够通过一定的方式在空间上足够的靠近(例如借助其他蛋白质的相互结合使其足够靠近),即使它们之间没有共价结合也可以激活转录.2拟合体质群的检测基于上述研究,科学家设想可以借助任何两个能相互作用的蛋白质为桥梁,将相互分开的DNA-BD和AD在空间上使它们彼此靠近,并重建一个具有功能的转录激活蛋白.这样,促使FieldS和SongO最终创立了酵母双杂交系统(图1).目前最成熟也最常用的DNA-BD和AD均来自酵母的GAL4蛋白质(它们分别定位于aa1-147和768-881).将编码已知蛋白质(常称为诱饵蛋白质,Baitprotein)的基因与编码BD的序列融合并在酵母中表达产生融合蛋白BD-Bait,同时将编码末知蛋白(该蛋白常称为Prey)的基因与编码AD的序列融合并在酵母中表达产生另一融合蛋白AD-Prey,借助Bait和Prey的作用使BD和AD相互结合并产生具有功能的转录激活蛋白,从而激活报导基因.如果Prey-Bait不能相互作用,则BD和AD不能结合,报导基因的转录则不能被激活,因此,可以通过检测报导基因是否被转录来研究蛋白质之间的相互作用.与许多传统的方法相比,酵母双杂交系统具有重大的突破:首先,整个操作均在体内进行(invivo),避开了传统的体外方法(invitro)中实验技术、条件对研究的不利影响;其次具有高灵敏度,尤其在检测蛋白质之间弱相互作用时更为突出.3报道基因的选择许多DNA激活蛋白包括原核激活蛋白的DNA-BD均可被用于酵母双杂交系统,最常用的DNA-BD是GAL4和LEX蛋白的DNA-BD,而最常用的AD则是GAL4和HSVVP16蛋白的AD.报导基因应该包括操纵子或者DNA-BD能够识别并结合的DNA序列如UAS.从理论上讲,任何能在酵母中表达的基因都可以作报导基因,较为常用的是LacZ,可以非常清楚地利用在X-gal存在时的颜色反应来筛选阳性克隆.比LacZ更为有效的是营养缺陷型标记,这种报导基因仅仅允许阳性克隆生长,因而更敏感、更实用.最常用的是His2和Leu.当然许多科学家更趋向于使用两种或两种以上的报导基因从而更灵敏、更准确地筛选阳性克隆.4母乳喂养系统的应用酵母双杂交系统是一个具有开创意义的研究方法,已经广泛地运用在分子生物学的各个领域,其最主要的用途有以下4个方面.4.1sv0基因缺失菌株多态性鉴定酵母双杂交系统创立之初就是为了用来研究已知蛋白质之间的相互作用.目前,通过该系统已经确定了许多重要蛋白质之间的相互作用,如利用该系统证实SV40的大T抗原可以与P53蛋白和R6蛋白相互作用,从而揭示了SV40引起细胞转化的机理;利用该系统证实了真核细胞的XRCC4基因产物能够与DNA连接酶IV相互作用形成复合体,然后作为免疫球蛋白成熟过程中V、J、D基因重排的信号直接促使基因重排和连接,最后产生具有功能的免疫球蛋白基因;在癌症起因的研究中,原癌基因编码的蛋白质功能尤为重要.酵母双杂交系统是目前最有效的研究方法,利用该系统已经研究了多种原癌基因产物与宿主细胞蛋白质的相互作用,如原癌基因产物RAS与丝氨酸/苏氨酸激酶RAF的相互作用,为最终破译癌症的起因积累了实验数据.4.2tnf-r族细胞的结构突变酵母双杂交系统是确定蛋白质作用功能区域(位点)的最有效的方法.当我们确定了两种蛋白质存在相互作用后,可以利用分子克隆技术将其中一种蛋白质进行一系列缺失突变,然后确定蛋白质之间相互作用的变化,从而确定蛋白质相互作用的重要功能区域,还可将蛋白质进行一系列的点突变以进一步确定影响蛋白质相互作用的重要氨基酸位点.KistonJ利用该系统研究了多种TNF-R族的细胞表面受体,发现它们均含有一个保守的由70～80个氨基酸组成的“死亡区域”,该“死亡区域”是引发细胞凋亡(apoptosis)的重要信号之一,并同时发现了一个新的具有“死亡区域”的TNF-R族的表面受体WSL-1蛋白(DR3/APO-3).4.3化合物的功能酵母双杂交系统的最为重要的用途就是从cDNA文库中寻找与已知蛋白质相互作用的未知蛋白质,将cDNA与AD序列相互融合,将已知蛋白基因与DNA-BD序列结合,检测报导基因的转录情况,寻找与已知蛋白质能相互作用的未知蛋白质,该方法已经证实了许多未知的蛋白质相互作用,揭示了大量未知蛋白质的功能及调控机制.YonganL发现腺病毒E3所编码的E3-14.7×103蛋白质能抑制TNF-α的功能,利用酵母双杂交系统从Hela细胞的cDNA文库中找到了一个特殊的宿主蛋白FIP-2,它是E3-14.7×103在细胞内的靶蛋白,E3-14.7×103通过与FIP-2结合来实现对TNF-α的抑制功能,从而揭示了腺病毒能够抑制肿瘤坏死因子功能的机理;乙肝病毒X基因的表达产物HBX是一个功能复杂的蛋白质,它在病毒的感染、复制、转录等过程中均起重要作用.MelegariM利用酵母双杂交系统从cDNA文库中找到与HBX结合的宿主蛋白IXP,证实IXP能够通过与HBX的结合抑制其活性从而改变病毒的复制周期,为研究HBV感染机制及治疗提供了有用的信息.4.4酵母双杂交系统所应用的药物在治疗肿瘤和病毒病、细菌病的方法中,基因治疗是最先进的、也是最具前途的方法,而基因治疗中最常用的“药物”就是“多肽”.利用酵母双杂交系统可以确定治疗用多肽与肿瘤、细菌、病毒来源的蛋白质的相互作用,从而精密揭示药物与细胞、组织、机体的相互作用,以确定基因治疗的分子机理,大大缩短实验到临床应用的时间.5酵母双杂交系统在生物化学史上用于研究蛋白质相互作用的方法很多,如交联、免疫、共沉淀、亲和层析等,这些传统的方法均采用体外实验(invitro)来研究蛋白质之间的相互作用,所以在研究蛋白质相互作用的过程中受到许多外界实验条件、环境、方法的影响,同时传统方法一般需要高浓度的蛋白质或抗体,纯化非常困难,会造成许多假阳性,而且无法精确测定蛋白质之间弱的相互作用.酵母双杂交系统彻底改变了传统方法(图2:A),采用体内实验(invivo)来研究蛋白质的相互作用,方法精确,不受外界影响,易于操作;更重要的是,所有操作均在核酸水平进行,无需纯化大量的蛋白质,可以精确测定蛋白质的弱相互作用;另一方面,酵母双杂交系统中的诱饵蛋白可以是完整的蛋白质,也可以是蛋白质的一个功能区,可以大到一个完整的肿瘤抑制蛋白,也可以小到一个约22个氨基酸的多肽,这更扩大了它的运用范围.尽管如此,酵母双杂交系统仍有一定的局限性.首先,该系统要求Bait蛋白能够被稳定地表达成融合蛋白,且该融合蛋白必须能被转运到细胞核内,因而不能被转运到细胞核内的蛋白质如细胞浆蛋白、细胞膜蛋白的相互作用的研究就不宜用该系统;同时如果某些哺乳动物细胞蛋白质是经过翻译后加工才能相互作用,则该系统也不适用,因为酵母的后加工系统与哺乳动物细胞后加工系统不尽相同.鉴于以上的不足,人们正在不断地改造酵母双杂交系统,因而近年来由该系统衍生出许多新的系统:一方面,为了研究膜蛋白的相互作用,Aronheimetal(1997)改造酵母双杂交系统创立了SOS募集系统(SOSrecruitmentsystem,SRS)(图2:B).在该系统中,蛋白质之间的相互作用被人为限制在酵母细胞膜上.酵母鸟苷酸交换因子(GEF)在正常情况下可以富集于细胞膜上并激活Ras蛋白,产生Ras途径,酵母能正常生长.但SRS系统中利用了GEF温度敏感型酵母突变株,该突变株在36℃不能生长.如果将人的GEF即SOS蛋白引入酵母突变株并富集在膜上则可以代替突变的酵母GEF,使突变株能生长.在SRS系统中,SOS蛋白与蛋白质Bait融合表达,蛋白质Prey与豆蔻酰化信号融合表达被定位于细胞膜上,蛋白质Bait-Prey的相互作用使得SOS蛋白能接近细胞膜并激活膜上的Ras蛋白,产生Ras途径,使突变株在36℃可以生长,反之则不能生长.利用SRS系统可以研究不能进入细胞核的蛋白质的相互作用.另一方面,为了弥补传统酵母双杂交系统不能研究需翻译后加工的蛋白质相互作用的缺陷,VidalM已经建立了哺乳动物的双杂交系统,当然该系统还存在许多不足.同时也可以利用激酶三杂交系统来研究需翻译后加工的蛋白质.在弥补不足的同时,科学家为了拓宽传统酵母双杂交系统的应用范围也创立了许多新的系统.目前最为成功的是三杂交系统(Three-HybridSystem)和逆向双杂交系统(ReverseTwo-HybridSystem).5.1种分子的相互作用三杂交系统利用了双杂交系统中的两个融合蛋白AD-Prey和BD-Bait,同时这两个融合蛋白的相互作用必须借助于第三种分子(见图2:C),而这第三种分子可以是蛋白质、小分子多肽和核酸,因而产生了蛋白质三杂交系统、激酶三杂交系统、小配体三杂交系统、RNA三杂交系统等.(1)诱导三种蛋白质的相互作用该系统仍沿用双杂交系统中的蛋白质Bait和Prey,但其稳定的相互作用必须借助于第三种蛋白质Z,Z可以介导Bait-Prey的相互作用或者诱导蛋白质构象的变化促使两者的稳定结合.(2)激酶作化酶如前所述,该系统可以被用来研究需翻译后加工的蛋白质.该系统利用酪氨酸蛋白激酶将其中一种蛋白质在特定位置上的酪氨酸磷酸化,磷酸化以后的蛋白质才能与另一种蛋白质相互作用.这种方法不仅仅局限于蛋白质的磷酸化作用,它可以引入多种翻译后修饰因子如甲基化酶、糖基化酶来研究需翻译后修饰的蛋白质的相互作用.(3)d-bait重及d-bait重序它是用来研究RNA与蛋白质相互作用的.首先与传统方法一样将蛋白质Bait与BD结合产生融合蛋白BD-Bait,将蛋白质Prey与AD结合产生融合蛋白AD-Prey,Bait与Prey不能相互作用,但Bait可以与一种RNA分子的部分序列结合,以此来检测该RNA分子的其他序列与未知蛋白Prey的相互作用.另外还有多肽三杂交系统和小配体三杂交系统,均是借助第三者的介导研究蛋白质的相互作用.5.2蛋白间相互作用酵母双杂交系统创立的宗旨是研究蛋白质之间的相互作用,但在实际中阻断蛋白质之间的相互作用的研究也非常重要.例如在癌症的研究中,如何阻断癌基因产物与宿主蛋白之间的相互作用,以及癌细胞之间信息的传递等都非常重要.Shihetal创立了研究如何阻断蛋白质之间相互作用的逆向双杂交系统(见图3).他在原系统中引入了E.coli的含有Tet-阻遏子(TetR)的操纵元和报道基因His3.如果两种蛋白质能相互作用,则激活TetR的转录,产生的阻遏蛋白结合到His3上游的Tet操纵元上,阻断了His3的表达,酵母菌表现为营养缺陷型;如果由于蛋白质的突变或其他分子的介入阻断了蛋白质的相互作用,则TetR不能被激活转录,His3能被正常表达.作者已成功地应用该系统对阻断cAMP效应分子结合蛋白(CREB)与辅助激活因子(CBP)相互作用的化学及生物诱变剂进行了研究.5.3酵母双杂交互交系统s单杂交系统(one-hybridsystem)(见图2:A):最早由双杂交系统改造而来的新系统是单杂交系统.将蛋白质Prey与AD融合