蛋白质组学研究方法及应用

蛋白质组学研究方法及应用

在过去10年中，人类终于完成了人类的出发计划，并完成了关于各种生物的全面重组的审查，表明生物研究已经进入了后基因组时代。后基因组时代的生命科学重心,已从解析生命的全套遗传信息(遗传密码)转移到系统研究这些遗传密码代表的实际意义(生物学功能)上来。尽管在mRNA水平也能一定程度地研究基因表达,如基因表达连续分析法(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)和微阵列芯片(microarraychip)。但是,近年来越来越多的证据表明,基因表达的中间产物mRNA水平的研究并不能取代蛋白质水平(基因最终表达产物)的研究。因为,mRNA与表达蛋白质的相关性不高(相关系数低于0.5),并且体内蛋白质还存在多种多样的与其功能密切相关的翻译后加工修饰。统计学表明1个基因在大肠杆菌中可表达1.4-1.5种蛋白,在酵母中可表达3种蛋白,在人中为10种蛋白。因此,要精确地研究基因的功能,还是要回到执行生命功能的蛋白质本身上来。与此前的蛋白质研究技术不同,后基因组时代的蛋白质研究是从整体水平上解析基因组表达的全部蛋白质的结构功能,这就需要有和基因组大规模测序技术类似的高通量研究手段。20世纪90年代中期,包括人类在内的多种生物基因组计划的完成累积了大量基因序列数据,并且这时候新出现的生物质谱技术已能对蛋白质进行高效灵敏地分析和测序,再加上计算机数据处理能力的大幅提高和互联网技术的逐渐应用,使得科学家一直期待的这种研究开始成为现实可能,并在此基础上诞生了一门研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的蛋白质组学。对应基因组学,(Genomics),Wilkins和Williams首次将蛋白质组学命名为Proteomics。我国科技界对此前沿学科也早有关注,本文将述评蛋白质组学的研究技术新发展和在果树学中的应用。1蛋白质组学含义蛋白质组(Proteome)泛指的是基因组表达的全部蛋白质。蛋白质组更为详细清楚的表述是,在特定时间/空间、特定的细胞/组织/体液,或特定的环境条件下(生理、药理和病理等)基因组表达的全部蛋白质。蛋白质组的研究则称之为“蛋白质组学(proteomics)”。广义的蛋白质组学指的是一切大规模水平的蛋白质研究(包括用高通量的晶体衍射技术进行大规模的蛋白质结构研究),但通常提到的蛋白质组学(包括本文在内)是用其狭义的定义,即用蛋白质组研究的3项核心技术(双向电泳、生物质谱和生物信息学)大规模地研究某一特定的蛋白质群体的组成、结构、活动规律和生物功能。即便是狭义的定义,蛋白质组学涵盖的范畴也很广,不但包括蛋白质的定性鉴定和定量分析,也包括蛋白质的加工修饰(翻译后剪切、磷酰化、糖基化、烷基化、泛蛋白化等)、亚细胞定位、相互作用研究以及最终的功能研究。1.1双向聚丙烯酰胺凝胶电泳的精确性双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离蛋白质的最有效的方法。与基因组研究不同的是,蛋白质组学并没有类似于PCR反应的扩增方法,因此,分离样品的精确性就成了至关重要的问题。目前常用的大规格胶(20cm×20cm)是可再生的,并且借助于考马斯亮蓝和银染,可以对蛋白质进行定量;应用荧光染料,还可以使一定范围内的上千种蛋白质定量地显现出来,这些都大大提高了双向聚丙烯酰胺凝胶电泳的精确性,当然双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术还远远没有达到完善的地步,例如要使低水平表达的蛋白质(每细胞10-1000个拷贝)显现出来仍有困难,而高水平表达的蛋白质(每细胞大于1000个拷贝)有时也会出现小部分的模糊。最近与双向聚丙烯酰胺凝胶电泳相关技术(如高度敏感的质谱和ESTs数据库的发展),使分离和鉴定蛋白质的工作又大大前进了一步。1.2生物分子的子化质谱技术是近年来蛋白质组学研究最重要的技术突破之一,其原理是将样品分子离子化,根据离子间质荷比(m/z)的差异来分离并确定质量,是高灵敏度高特异性地快速鉴定生物分子的技术。质谱测定中首先将通过双向聚丙烯酰胺凝胶电泳分离到的蛋白质用特定的蛋白质酶(例如胰蛋白酶)消化成肽段,然后用质谱仪进行分析。1.3蛋白质的生物学功能蛋白质组学研究中的一个关键问题是蛋白质与蛋白质的相互作用。这种相互作用可以直接了解蛋白质的生物学功能。蛋白质芯片技术可在同一时间内分析成千上万种蛋白的变化,这就使在基因组水平上鉴定蛋白质功能(例如酶活、抗体专一性、配基-受体的相互作用、蛋白质间的相互作用、蛋白质与核酸间的相互作用或蛋白质同小分子物质间的相互作用等)成为可能。1.4双向高效柱层析双向高效柱层析实际上是先进行一次分子筛柱层析,从柱上流出的蛋白峰自动进入第二向层析,通常是利用蛋白质表面疏水性质进行分离和双向电泳相比,双向高效柱层析的优点是可以适当放大,分离得到较多的蛋白量以供鉴定;另一个优点是流出的蛋白峰可以直接连通进入质谱进行鉴定,避免了“印迹”的步骤。1.5带格朗日合理规划orfs编码的蛋白质的作用酵母双杂交系统最早用于研究蛋白质与蛋白质的相互作用。转录因子具有一个DNA结合域(DNA-BD)和激活域(AD),二者紧密结合相互作用能使一系列基因的转录。由ORFs编码的蛋白在酵母中表达并相互作用时,GAL4-BD和GAL4-AD便紧密地结合在一起,进而起始报告基因的转录。只有表达出靶蛋白的克隆才能在缺陷培养基上存活并得以维持。然而,酵母双杂交只能了解已知蛋白质中可能存在的相互作用。最近出现一种改良的酵母双杂交方法,称为“反向”双杂交,可用于鉴定阻断蛋白质与蛋白质相互作用的物质和多肽。1.6数据库的整合标准的且可重复的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质分析方法使得大规模的蛋白质组研究成为可能,再加上其它技术的辅助(如蛋白质免疫检测、微序列分析、质谱等),可以获得大量的蛋白质表达的信息。这些信息可以贮存在蛋白质数据库中,并与其它数据库相联接。通过互联网可以查到的植物蛋白质组数据库有:http://psort.nibb.ac.jp目前的数据库集中在模式植物拟南芥,重要的粮食作物水稻、玉米以及松树等植物上。这些数据库都提供可以点击的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳图像,还包括植物各器官(根、茎、叶、芽、种子)、各组织(愈伤组织、木质部、韧皮部)或基因型间多肽形式的比较。蛋白质组数据库的一个重要特征是它们建立了与基因组计划的联系。目前的蛋白质组数据库所包含的植物都是已完成或正在进行系统测序的物种。有的是在基因组水平(如拟南芥、水稻),有的是在转录组水平(如拟南芥、玉米、水稻、松树的表达序列标签ESTs)。利用蛋白质组数据库和ESTs数据库,第一次将植物中的转录与相关的蛋白质联系起来。2柑橘花芽诱导、组织化学和基因型及诱导材料的研究进展蛋白质是生命现象的表现形式,是生理功能的执行者,是生命活动的直接体现者。蛋白质组学研究的一大特色,便是从一开始就呈现出基础研究与实际应用研究并驾齐驱的趋势。但果树的基因组比较庞大,测序任务目前在国内外鲜有完成,从基因水平了解果树还需要一段距离。因多数果树是多年生、世代长、高度杂合,生长周期长,杂交或自交后代不易获得,不同生理阶段具有形态和结构的差异,为此,国内外在果树学研究中开展蛋白质组学研究还没见报道,但蛋白质组学研究技术具有的高通量、大规模、整体性蛋白质水平的研究是目前了解果树生长、发育的有利工具,尤其是果树开花坐果等重要的生命活动,都离不开生物体结构和功能的执行者——蛋白质的参与,所以蛋白质组学研究技术在果树学中的应用有广阔前景。我国从1997年开始了蛋白质组研究,并于2000年在Electrophoresis杂志上由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所Mary和Lope发表了蛋白质组研究论文,该所和生物信息中心还建立了蛋白质组数据库网站WWW.。现在,我国建立起基本蛋白质组平台技术的有中国科学院上海生命科学研究院、军事医学科学院、湖南师范大学生命科学学院、中国科学院大连化学研究所、复旦大学等等,已相继开展了相关研究,形成了一支专业蛋白质组研究队伍。2001年,国家科技部将蛋白质组研究确立为“973”和“863”计划项目,使我国的蛋白质组研究进入了一个新阶段。我们也在多年研究苹果花芽分化机理的基础上,正在利用SDS和IEF-PACE电泳技术开展花芽孕育期叶和芽不同时期蛋白质组差异以及leafy成花基因导入后蛋白质表达研究。Buban等在苹果成花机理研究中看到不成花短枝顶芽中组蛋白较成花短枝顶芽中多。温州蜜柑诱导芽和非诱导芽的提取物存在着蛋白质数量、质量的差异,花芽孕育使芽内核酸合成增加,但由于未分离出特定的mRNA,故孕育期间蛋白质差异的意义尚不清楚。王凤华等以龙眼胚性培养物为材料,使用Pharmacia多功能水平电泳仪(MultiphorⅡ),采用滤纸半干电泳与梯度凝胶技术,建立了适合于龙眼胚性培养物的蛋白质水平双向电泳技术体系。使用该技术有望对龙眼体细胞胚胎发生过程中特异蛋白进行研究。何绍兰等对金柑、椪柑和温州蜜柑在促、抑花调控处理,并利用SDS和IEF-PACE电泳技术,分析了金柑、椪柑和温州蜜柑在受促、抑花处理后芽体的蛋白质图谱变化动态。结果表明,在柑橘花芽诱导期,经GA3或BA抑花处理的芽组织中均有新的小分子蛋白质或中性至弱碱性蛋白质出现。随着花芽由生理分化向形态分化过渡,环割处理芽中出现小分子或酸性特异蛋白质,可能表明柑橘成花或抑花具有不同的基因表达与蛋白质代谢特征。进一步证实了因处理时间不同,BA对柑橘花芽分化具有促进或抑制的双重作用。刘昌文等采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,研究了柑橘属4个种的6个品种,2个营养系芽变品系和1个杂交后代的成熟春梢的叶片酯酶谱和蛋白质电泳带型。根据酶谱及带型的异同,探讨其彼此的亲缘关系,鉴别芽变品系和杂种,结果表明,酯酶同工酶酶带清晰,种间酶带差异明显,种内不明显。蛋白质电泳带无拖尾现象,清晰而窄,种间和种内不同品种间谱带差异明显;芽变品系具有原品种所有带型,并出现新的谱带;种间杂种带型复杂,谱带条数多,不仅具有双亲所具有的谱带,又不完全表现为两亲本谱带的互补型,亲本所具有的个别谱带在子代中消失,而且出现了双亲所不具有的杂种谱带。柑橘叶片酯酶同工酶分析,可作为探测基因差异和遗传关系的一种手段,其酶谱可作为鉴别种以上遗传性状的指标,叶片蛋白质电泳,可用来进行种或品种区分,有效地鉴别芽变品系和杂种。陈杰忠等在人工气候室中,低温胁迫引起香蕉和大蕉叶片组织中可溶性蛋白质的组分发生明显变化。SDS图谱谱带显示:当温度降至1℃时,香蕉叶片中分子组成约为1.13×105和6.45×104的2种多肽含量明显增加,并新增加一种分子组成约为1.20×105的多肽,低温胁迫下大蕉的表现基本与香蕉的相似,只是分子组成约为1.20×105的多肽在10℃时已隐约出现,推测该多肽可能与香蕉和大蕉的抗冷性有关。随着温度的降低,可溶性蛋白质、游离脯氨酸含量呈上升趋势;其中,抗冷性较弱的香蕉叶片中可溶性蛋白质和游离脯氨酸的含量高于抗冷性较强的大蕉,但大蕉的增加幅度高于香蕉。张以顺等连续3年对典型的荔枝焦核品种桂味、糯米糍和大核品种黑叶、怀枝花后10-40d的幼胚和胚乳中蛋白质动态变化进行研究。结果表明:焦核品种中胚和胚乳中的蛋白质含量均低于大核品种。蛋白质电泳结果显示,22.5、28.5、45kDa这3类蛋白质在怀枝和黑叶的胚蛋白质代谢过程中表现出较高的稳定性,桂味和糯米糍胚蛋白质中的28.5kDa蛋白质也有相似的特性。陶月良等研究表明:板栗种子成熟脱落时,胚轴内可溶性蛋白含量高于子叶,热稳定蛋白含量低于子叶,胚轴热稳定蛋白占可溶性蛋白的比值在90d最高。SDS表明,胚轴与子叶的可溶性蛋白谱带差异较大;子叶含有较多的热稳定蛋白,胚轴的热稳定蛋白为20、12kDa蛋白,105d时仅剩12kDa蛋白。陈伟等研究了荔枝胚胎蛋白质双向电泳技术,在试样制备、电泳及银染等方面进行了技术改进,探索出一种可获得稳定、清晰的双向电泳图谱的方法。凝胶银染后,可分辨蛋白质斑点数约有300个,蛋白质等电点在pH3.5-9.5,大多在pH5.0-8.0,相对分子质量为15000-90000,大多为25000-70000。薛妙男等比较分析了沙田柚自交授粉花柱和异交授粉花柱的双向凝胶电泳图谱,两者的蛋白质分布格局相似,具有重叠性,可分析出100多种蛋白质,在自交花柱电泳图谱中发现3种特异蛋白质(A、B、C),A蛋白质MrA=32.0ku,pI=7.2;B蛋白质MrB=26.0ku,pl=7.2;C蛋白质MrC=25.0ku,pl=6.5,这3种特异蛋白质可能与自交不亲和性相关。陈伟等还应用改进的IEF-SDS技术比较分析了荔枝胚胎分化发育过程中蛋白质组分化的变化。结果表明,大多数蛋白质组分在各发育时期的图谱相似,但不同发育时期存在变化。试验共发现了前期鱼雷胚的43.7kDa、pI3.5和55kDa、pI9.4,后期鱼雷胚的23.4kDa、pI6.6和25.1kDa、pI6.8以及前期子叶胚的25.1kDa、pI9.3和64.6kDa、pI5.9等6个新出现的特异蛋白。后期心形胚的图谱上蛋白质点数最多,可分辨蛋白质斑点数约为300个,这与蛋白质含量的测定结果一致。以上特异蛋白在多次重复中均显示出良好的重