从基因组学到蛋白质组proeame

从基因组学到蛋白质组proeame

完成人类工作组计划（hgb），极大地促进了后基因组时代的开始。基因数量有限性和结构相对稳定性与生命现象复杂性和多变性之间的巨大反差,使人们的目光逐渐从基因组学转向蛋白质组学,作为生命活动执行者,基因组编码的所有蛋白质随之成为研究热点。1994年澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams等第一次提出了蛋白质组(Proteome)概念,“Proteome”是由蛋白质(protein)与基因组(genome)两个词的杂合,意指“一种基因组所表达的全部蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能和相互作用等。人们要更好的研究蛋白组学,就要有足够的技术支持,所以双向电泳、生物质谱、蛋白芯片、酵母双杂交系统、生物信息学等蛋白质组学的各种实验技术逐步发展起来,下面本文对蛋白质组学主要实验技术研究进展进行介绍。1-de-pcr法双向电泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率等优点。1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术,大大提高了蛋白质分离的分辨率而得以广泛应用,至今经历了30多年的发展,双向电泳技术已较为成熟。目前主要应用的是Gorg等建立的固相pH梯度的凝胶电泳(IPG-DALT),Gorg于1998年发展了一种pH更宽的IPG胶条,碱性范围达到了12,这种电泳具有分辨率高、上样量大、重复性好的优点,并且可与质谱联用对蛋白质进行鉴定。2-DE也有明显的局限性:如重复性差;自动化程度低,费时费力;对过大(>100ku)和过小(<10ku)的分子量的蛋白质、低丰度蛋白质(<1000copies)、极酸或极碱和难溶的蛋白质如膜蛋白等分离困难。近些年来人们针对2D的局限不断改良,双相荧光差异凝胶电泳(2D–DIGE,2DDifferentialIn-gelElec-trophoresis)这项技术使2D的重现性有了进一步的提高。利用免疫亲和技术,可以有效地去除血浆白蛋白及IgG等高丰度蛋白而相应富集了血浆中剩余的低丰度蛋白,从而增加2-DE分离及检测的蛋白点数,明显提高了分离效率。最近,又出现了一些新的蛋白质分离技术,如多维色谱技术、亲和色谱技术和毛细管电泳等。其中最有发展前景的是多维色谱技术,该技术最突出的优点是对全蛋白质组分进行分析时的歧视效应大大减小,而且可以实现蛋白质分离与鉴定的在线联用,有利于蛋白质组研究的自动化和高通量化。虽然2-DE有一些局限性,但仍是目前大规模分离蛋白的最有效手段。2离子陷阱质谱新技术质谱技术(massspectrometry,MS)常与双向电泳等蛋白质分离技术联用,它具有灵敏度、准确度、自动化程度高的特点,是蛋白质鉴定的核心技术。1906年,Thomson发明了质谱,在随后的几十年里,质谱技术逐渐发展成为研究、分析和鉴定生物大分子的前沿方法。到20世纪80年代中期,出现了以电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解析电离(MALDI)为代表的软电离技术,即样品分子电离时,保持整个分子的完整性,不会形成碎片离子。通过肽质量指纹谱(peptidemassfingerprinting)、肽序列标签(peptidesequencetag)和肽阶梯序列(peptideladdersequencing)等方法,结合蛋白质数据库检索可实现对蛋白质的快速鉴定和高通量筛选,拓展了质谱的应用范围,形成了一门新技术—生物质谱技术。生物质谱由于离子源和质量分析器的不同,产生了电喷雾离子化飞行时间质谱(ESI-TOF-MS)技术、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术等多样的生物质谱技术。采用MALDI-TOF-MS测定肽指纹图谱是当前蛋白质组研究的常用鉴定方法,无需纯化蛋白,可同时鉴定多个蛋白质,具有灵敏度高、准确度高、易自动化的特点,是蛋白质组学的一个重大突破。而且随着搜索数据库算法的增强,MALDI-TOF-MS方法得到进一步的发展。此外,近几年来,以信息为基础的评分功能(knowledge-basedscoringfunctions)可以快速选择候选评分复杂蛋白质,使鉴定精度大为提高。实验者为了进一步鉴定蛋白质,通常使用串联质谱进行肽段序列分析。用串联质谱测定肽序列更为复杂,且操作费时,难于实现高通量,但离子阱质谱(Iontrap-MS)的应用解决了这个问题,其可实现时间串联的特点,即串联质谱的每个阶段在不同时间段进行,使用一个离子阱质量分离装置就可以完成串联质谱的分析,甚至可进行多级质谱分析。串联质谱虽然复杂,但它具有可直接读出肽序列的优点。另一种质谱技术,MALDI-TOF-MS与四极/直角加速飞行时间(quadrupole/orthogonalaccelerationtime-of-fligh,tQqoaTOF)质谱联合,兼具了肽指纹图谱的大规模和串联质谱的可直接获得肽序列的双重优点,可用于测定蛋白质或多肽的精确分子量。最近,离子化技术又有了新发展,随之出现了表面增强激光解吸电离-飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS),它是蛋白质芯片和MS两种技术的结合,具有灵敏度高、样本要求低等特点,适用于判别各种疾病的特异性蛋白,在疾病的早期诊断、鉴别诊断、预后判断和疗效观察方面有潜在的应用前景。通过ESI和解吸离子化(DI)两大离子化技术相结合又发明了电喷雾解吸电离(DESI)技术,这项技术具有可以直接、快速地分析待测物,在进行蛋白质序列分析时具有分析速度快、易于自动化的特点,在未来必将得到广泛应用。3生物芯片技术蛋白芯片又称蛋白微阵列芯片(proteinchiporproteinmicroarray)凭借其高通量、高特异性和高灵敏度等优点,在蛋白组学中的应用受到了广泛关注,并越来越多地应用于蛋白质表达谱、蛋白质生物活性测定,蛋白芯片在蛋白质组的功能研究、疾病诊断以及药物开发中显示出巨大的潜力。蛋白质芯片和基因芯片都属于生物芯片范畴,是随着人类基因组计划(HGP)的实施而产生的用于生命科学研究的新技术、新方法。由于生物芯片技术中基因芯片技术的不断成熟以及多次取得令人瞩目的成果和蛋白质组学对新技术的需要,对蛋白芯片技术的研究应运而生。蛋白质芯片具有快速、高效、平行、高通量的优点。但蛋白质芯片也存在一定的问题,载体材料表面的化学修饰方法及蛋白固定化技术还需要进一步改进,信号检测方法的灵敏度有待进一步提高。从德国科学家Lueking研究蛋白芯片开始,人们对蛋白芯片技术不断改进,Shao等用滚环信号扩增(rolling-circlesignalamplification,RCA)技术可以同时对150种细胞因子进行检测,这项技术可以使荧光信号显著增强。纳米标记的引入,也大大提高芯片检测的灵敏度,针对标记分子会影响蛋白活性的问题,wangZH等提出了“光学蛋白芯片”的概念,这种芯片通过表面格式化、表面改良和配基固定形成多元生物活性感应表面,借助高分辨率的生物光学显微成像技术达到识别和检测蛋白质的目的。近年,科学家利用免疫胶体金技术和银显影技术进行有机的结合,建立了可视化蛋白质芯片技术平台,还有,糖芯片、反向芯片、夹心法抗体芯片逐步发展起来。同时,蛋白芯片与其它技术的联合使用也得到了发展,像蛋白质芯片-飞行质谱仪,它具有快速、操作简便、样品用量少和对多样品的平行检测等特点,可直接检测不经处理的各种体液和分泌物等,从而可检测到样品中特异性蛋白质的分子质量。因此,在蛋白质组学的研究中较目前常规方法具有显著的优势。4农村基因作用的激活酵母双杂交系统(Yeasttwo-hybridsystem)是研究蛋白质相互作用的强有力的工具。自1989年Fields和Song建立酵母双杂交系统以来,已被人们用来检验已知蛋白质之间的作用、发现新的蛋白质和蛋白质的新功能、建立蛋白相互作用图谱等,其应用广泛,作用强大。最初酵母双杂交系统在分析可能相互作用的蛋白质时必须定位于核内才能激活报告基因,对研究核外和细胞膜上的蛋白相互作用,它的应用就受到了限制,目前已开发研究了通过改变某些细胞膜定位序列,在载体中添加核定位信号序列的方法,以及专门研究非核内蛋白作用的系统。酵母双杂交系统的缺陷在于检测蛋白与蛋白之间的作用时可以产生很高的假阳性率和假阴性率,文献报道假阴性率可以高达90%,但是这种缺陷可以通过报告基因和聚合酶的改进而提高检测准确率。随着蛋白组学的发展,酵母双杂交系统得到了补充和发展。Li提出了酵母单杂交系统,它有着非常高灵敏性。随后SenGupta在双杂交技术基础上又发展了酵母三杂交系统,它在信号转导中起重要作用,其应用范围比双杂交系统广泛,但对于在超过3种成分更为复杂的相互作用则无能为力。人们还发明了反向双杂交系统、核外双杂交系统等,反向双杂交系统在药物筛选中有着广阔的应用前景。近年,人们不断发明研究蛋白质相互作用的新技术,像噬菌体展示技术,同酵母双杂交系统相比,噬菌体展示技术同样具有简便、高通量的优点。表面等离子体共振技术,它除应用于检测蛋白质间的相互作用外,还可检测蛋白质与核酸及其他生物大分子之间的特异性相互作用,因此比传统方法更具优势。5生物组织学检测蛋白质组学中的应用生物信息学是一门交叉科学,它包含了生物信息的获取、加工、存储、分配、分析、解释等在内的所有方面,它综合运用数学计算机科学和生物学的各种工具,来阐明和解释大量数据所包含的生物学意义。生物信息学在蛋白质组学的研究中起到了特殊的重要作用,因为蛋白质组研究提供的数据的数量之巨大在生物学史上是史无前例的。而且,蛋白质组比基因组具有更大的复杂性,因而蛋白质组信息学更有挑战性。生物信息学在蛋白质组学中的应用很广泛,通过双向凝胶电泳、生物质谱等方法获得的大量数据始终都必须依赖生物信息学的方法和手段对蛋白质的种类、数量、结构和功能进行最后确定。生物信息学在对蛋白质的结构和功能的预测上也起到了重要作用。6生物质谱技术的应用作为21世纪的核心科学之一,蛋白质组学及其研究技术得到了迅猛发展。蛋白质组学的发展得益于研究技术的不断突破。在研究技术上,发展可替代或补充双向凝胶电泳的新方法和新的生物质谱技术已成为蛋白质组研究技术最主要的目标。目前,双向凝胶电泳不断改进和完善,同时,还出现了二维色谱(2D-LC)、二维毛细管电泳(2D-CE)、液相色谱-毛细管电泳(LC-CE)和二维色谱-串联质谱(2D-HPLC/MS-MS)等新型分离和鉴定技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。生物质谱技术也已经取得了长足的进展,可以在不需要对蛋白质混合物进行分离的前提下,直接分析和鉴定全蛋白质组样品新型质谱技术成为人们研究的新方向。质谱技术为蛋白质结构研究提供了强大的技术支持,将生物质谱技术与蛋白质分离纯化技术及蛋白质化学修饰等技术相结合,可对蛋白质结构进行深入研究,蛋白质结构研究的不断发展,要求生物MS技术向更快、更灵敏、更可靠的方向发展。随着现代科学技术的不断进步,蛋白质组学的其它实验技术也得到了迅速发展,蛋白芯片的发展把蛋白组学乃致整个生命科学推向了新的高度,保持固定蛋白的活性,提高蛋白芯片的检测灵敏度都将是蛋白芯片的发展方向。酵母双杂交系统正得到不断地完善和发展,