基因工程重点总结

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名词解释：

基因工程：重组DNA技术或者基因转移技术，在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之渗入到原先没有这类分子的宿主细胞内，而能持续稳定的传递和表达。

报告基因：其编码产物能够被快速测定，常用来判断外源基因是否成功地导入受体细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特别用途的基因。双元载体：由两个分别含有T—DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒载体系统。受体系统：用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源基因的整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。

正负选择法：哺乳动物细胞转染DNA发生随机整合的几率相当高，而同源重组的频率则相当低。正是由于这种起因，给哺乳动物细胞的基因定向插入事件的检测造成了很大困难。用于富集同源重组事件的特别试验体系，涉及正选择和负选择两个方面。

基因靶标：通过在转染细胞中发生的外源基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组，使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变系把你遗传特性的目的。密码子使用的偏爱性：无论是真核基因还是原核基因，一种特定的氨基酸并不是以同等频率使用所有的同义密码子，而主要使用其中的某一两种。这种密码子使用的非随机性现象选择标记基因：用于鉴别目标DNA的存在，将成功转化了质粒的宿主挑拣出来的基因。主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。

HAT选择法：由于选择TK+细胞的培养基含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷，所以称之为。生殖细胞浸泡法：将供试外植体如种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗悬浮细胞培养物等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用渗透作用把外源基因导入受体细胞并稳定地整合、表达和遗传。

胚囊、子房注射法：使用微量注射器把外源DNA溶液注射到子房或胚囊中，由于卵细胞的吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中，从而获得转基因的种子。

启动子：RNA聚合酶识别并结合，从而起始转录的一段特异DNA序列。加强子：加强与之相连锁的基因转录活性的调控序列。

先导序列：从真核基因mRNA5’端帽子到起始密码子之间不翻译的核苷酸序列。胸苷激酶TK：核苷酸合成代谢途径中的一种酶，能够将胸苷转换为胸苷一磷酸。InPlanta转化：利用花粉粒及花粉管通道、子房、幼穗及种胚导入外源基因。

花粉管通道介导基因转化：授粉后，外源DNA能沿花粉管渗入，经过诛心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。愈伤组织再生体系：外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并通过分化培养能获得再生植株的受体系统。

直接分化再生系统：外植体细胞越过脱分化阶段而直接分化出不定芽获得再生植株。用叶片、幼茎、子叶、胚轴等外植体，直接出芽。胚状体再生系统：二倍体或单倍体细胞在未经性细胞融合的状况下，模拟有性合子胚胎发生的各个阶段而发育形成一个新的个体的形态发生过程。

生殖细胞受体系统：以生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统。种质系统。

基因枪法，微弹轰击法：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。

种质系：合子胚中特定细胞将来分化发育成植物体的特定器官和部位。

原生质体的基因转化：以原生质体为受体的基因转化。PEG法、脂质体法、电激法、超声波法、激光打孔法等。

脂质体法：用脂类化学物质包裹DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把内含物转入受体细胞。

脂质体：是人工构建的由磷脂酰胆碱或磷脂酰丝氨酸等组成的双层膜囊。电激法介导的基因转化：利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上电激穿孔形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的导入。显微注射介导基因的转化：利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞质或细胞核中。激光微束介导的基因转化：将激光引入光学显微镜聚集成微米级的微束照射培养细胞后，在细胞膜上可形成能自我愈合的小孔，使参与细胞悬浮液里的外源DNA流入细胞，实现基因的转移。

生物反应器：用于生物反应过程的容器总称。包括酶反应器（游离酶和固定酶）、固定细胞反应器、各种细胞培养器、发酵罐和转基因动植物等。

Bradford法：考马斯亮蓝与蛋白质结合产生蓝色，595nm处有最大吸收值。

基因水平转移HGT：遗传物质从一个有机体向另一个与供体有性不亲和的有机体转移酵母双杂交系统：将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子的DNA结合结构域基因和GAL4激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。

物理图谱：表示某些基因与遗传标志之间在基因组上的直线相对位置和距离的图谱。遗传图谱：由基因重组测验结果推算出来的、在一条染色体上可以发生的突变座位的直线排列（基因位点的排列)图。

染色体步查：从染色体上某一位置（某一DNA克隆）出发，在基因组文库中筛选出与该DNA末端序列有互补序列的DNA克隆，亦即与该DNA一端相邻接的DNA片段一步一步达到靶DNA序列。

双分子荧光互补：荧光蛋白切割成两个多肽连接到两个相互作用的蛋白质上重新发出荧光。分子伴侣：阻止副反应保证其他蛋白质的正确折叠的蛋白质。

N端法则：生物体内蛋白质的新陈代谢的稳定性主要取决于N端氨基酸的性质。

转化受体：高效稳定的再生能力，较高的遗传稳定性，具有稳定的外植体来源，对选择性抗生素敏感，对农杆菌的侵染有敏感性。

基因漂移：转基因植物通过花粉漂移或种子扩散将基因转入同一物种或相关物种。瞬时表达：转入的基因在植物当代表达或是分化时表达稳定性表达：转入的基因能稳定的遗传给子代并得到表达

核基质附着区MAR：存在于真核细胞染色体中的一段与基质特异结合的DNA序列。

简答：

真核生物基因在原核生物系统表达的载体的基本组成：

1、强启动子2、转录终止子3、翻译起始序列4、翻译加强子5、翻译终止密码

启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞生理特征等都会不同程度地影响克隆基因的表达效率

克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达1、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位细胞质，细胞周质，分泌到细胞外

使克隆基因表达的外源蛋白分泌到胞外的培养基中，是获得蛋白质稳定性的最正确途径。2、外源蛋白在大肠杆菌中的稳定性（1）蛋白质的降解作用

1）让外源蛋白定位在周质或胞外表达2）使用蛋白酶缺陷的大肠杆菌做表达菌株

3）将转化有克隆基因的寄主菌株放置在低温环境中生长4）使目标基因以融合蛋白形式表达

5）置换多肽链中的某些氨基酸，清除蛋白酶切点6）对目标蛋白质作疏水性修饰

（2）结构决定因子与蛋白质的稳定性N端法则

（3）表达自然的蛋白质

以形成融合蛋白的形式在大肠杆菌细胞中表达外源真核基因有大量方面的优越性（4）分子伴侣的稳定作用指一类多功能蛋白质，能够通过阻止诸如聚合作用这样的副反应，来促使其他蛋白质按正确的方式折叠，而本身却不是最终形成的功能蛋白质的组成成分。

通过分子伴侣与克隆的外源基因在大肠杆菌寄主细胞中的共表达是加强目标蛋白的稳定性，实现高水平表达的有效方法。

（5）大肠杆菌突变体菌株与蛋白质的稳定性使用胞内蛋白酶含量很低的大肠杆菌突变株，作为表达外源蛋白质的寄主细胞，其中用得最多的是缺失Ion蛋白酶的大肠杆菌突变株。

影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素1、启动子对克隆基因表达效率的影响1）启动子的结构对表达效率的影响

启动子序列与上述保守序列之间相像程度越高，其表达能力也就越强。两个保守序列之间的距离，接近于17个碱基。

2）启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响5’端与SD序列之间的距离应15bp3）提高克隆基因表达效率的试验方案2、质粒载体的生物学特性与基因表达效率1)质粒的拷贝数a、启动子的强度

b、基因的拷贝数，即基因剂量，最简单的方法是将基因克隆到高拷贝的质粒载体RNAI和Rom蛋白质2)质粒载体的不稳定性a、将Par克隆到表达载体b、对无质粒细胞进行反选择

3、mRNA转录本身的分子特性对基因表达效率的影响

1）翻译起始序列

SD序列：大量细菌基因起始密码子5’上游都存在5——10个核苷酸的核糖体结合位点（RBS），包含5’UAAGGAGG3’的全部或其中的一部分。2）mRNA的稳定性

mRNA分子的相对寿命，或对内源RNase降解作用的抗争能力。5’——UTR系列和3’——URT系列以及顺反子间区4、遗传密码子的使用1）密码子使用的偏爱性

a、细胞中同工tRNA的丰度差异

b、嘧啶碱基结尾的密码子（C或U)之间的非随机选择5、寄主细胞的生理状态

培养基的营养成分、细胞培养方式、以及培养温度和培养基中所溶解的氧等。

HAT选择法及其原理

由于选择TK+细胞的培养基含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷

基本原理：假使用叶酸的类似物氨基蝶呤处理细胞，二氢叶酸还原酶便被抑制，培养基中的还原辅助因子四氢叶酸因得不到补充而逐渐耗尽，于是从dUMP合成dTTP，以及dATP和dGTP的重新合成便因此被阻断，但次黄嘌呤是daATP和dGTP补救合成途径的一种底物。培养基中补加有此种物质时，细胞能逾越氨基蝶呤的抑制作用，

由于在HAT培养基中补加有外源的胸苷，所以TK+细胞通过胸苷激酶的作用可把它合成为dTTP，继续存活下去，而TK—细胞则不会发生这种合成，因而死亡。把正常的tk基因导入TK—细胞，它们也就照样能存活下去。所以使用HAT培养基，能够选择出由tk基因转化而来的TK+细胞。

正负选择法及其原理

转染DNA与内源基因组DNA之间的同源重组事件，是由转染DNA的自由末端激发的。哺乳动物细胞转染DNA发生随机整合的几率相当高，而同源重组的频率则相当低。正是由于这种起因，基因定向插入事件的检测造成了很大的困难。用于富集同源重组事件的特别的试验体系，涉及正选择和负选择。

正选择：neo基因叫做正选择标记基因，可抑制抗菌素G418的活性。因此，获得的neo基因的转化细胞呈G418抗性，能够在含有G418抗菌素的选择培养基中生长存活。

负选择：HSV—tk基因叫做负选择标记基因，它编码的单纯疱疹病毒胸苷激酶，可以把核苷类似物，例如鸟嘌呤(GCV)，转变成毒性的核苷酸，造成细胞中毒死亡。因此，选择培养基中的GCV能够特异性的杀死表达HSV—tk基因的转化细胞。

图位克隆：

1、建立目的基因的遗传分开群体

2、找到与目的基因紧凑连锁的分子标记

3、用遗传图或物理作图将目的基因定位在染色体特定位置4、构建含有大插入片段的基因组文库

5、以与目的基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库6、用阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群

7、通过染色体步移、登陆或跳查，获得含有目标基因的大片段克隆8、通过亚克隆获得目标的小片段克隆

9、通过遗传转化和功能互补验证，最终确定目标基因的碱基序列

常用的选择标记基因：新霉素磷酸转移酶基因潮霉素磷酸转移酶基因Bar基因

EPSP合成酶基因

报告基因：GUS基因，绿色荧光蛋白，荧光素酶基因，氯霉素乙酰转移酶基因

根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化：1、对受体的识别

2、浮着到植物受体细胞3、诱导启动毒性基因

4、类似接合孔复合体的合成和装配5、T—DNA的加工和转运6、T—DNA的整合

无标记的转化策略：

1、农杆菌介导的共转化法

2、位点特异性