黄酒生麦曲中蛋白酶含量的测定

黄酒生麦曲中蛋白酶含量的测定

黄酒的种植是一种影响多种因素的微生物发酵过程。母乳素是主要的发芽剂，曲线是主要的糖化剂。曲线中含有多种酶，主要包括液化酶、糖化酶和丙烯酸。这三种酶的大小直接影响糖化和发酵的效果。曲霉菌中的蛋白质分解酶对原料中的蛋白质进行水解形成多肽、低肽及氨基酸等含氨化合物,能赋于黄酒特有的风味并提供给酵母作为营养物质。下面着重来分析一下黄酒生麦曲中的蛋白酶活力。蛋白酶活力的检测方法一般常用的有二种:一、福林法;二、紫外分光光度法。但制备福林试剂比较麻烦而且有较强的毒性,所以我用紫外分光光度法来测定。紫外分光光度法1材料和方法1.1紫外可见吸收光谱蛋白酶在一定条件下,水解酪蛋白底物,然后加入三氯乙酸终止酶反应,并使未水解的酪蛋白沉淀除去,滤液对紫外光有吸收(分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后,发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱)。可用紫外分光光度法测定,根据吸光度计算其酶活力。2酸酸酶缓冲液配制2.10.4mol/L三氯乙酸溶液:称取65.4g三氯乙酸,用水溶解并稀释至1000mL。2.21M盐酸溶液与0.1M盐酸溶液:量取0.85mL浓盐酸(比重1.19)用水稀释至100mL。量取8.5mL浓盐酸(比重1.19)用水稀释至100mL。2.3乳酸缓冲液(pH=3.0)适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸(80%~90%)10.6g,加水溶解并定容至1000mL。乙液称取乳酸钠(70%)16g,加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取甲液8mL,加乙液1mL,混匀,稀释1倍,即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。2.410g/L酪素溶液称取酪素1.000g,精确至0.001g,用少量浓乳酸2~3滴湿润后,加入适量的乳酸缓冲液约80mL,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100mL容量瓶中,用乳酸缓冲液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存,有效期为3天。2.5100μg/mLL-酪氨酸标准溶液3设备和设备3.1恒温水浴(40±0.2)℃。3.2紫外分光光度计。4测量步骤4.1标准曲线的绘制4.1.1标准曲线的绘制吸取0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL标准酪氨酸溶液(100μg/mL),分别置于试管中,分别补水10mL、9mL、8mL、7mL、6mL、5mL,稀释后酪氨酸溶液浓度为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL,然后,直接用紫外分光光度计在275nm的波长下测定其吸光度(A),以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度C为横坐标,绘制标准曲线(此线应通过零点)。根据作图,计算出吸光度为1时的酪氨酸的量(μg),即为吸光常数K值。(其K值应在130~135范围内)。4.2酶溶液的制备称10.0g绝干曲试样,加乳酸缓冲溶液50mL,在30℃浸出1h(每隔15min搅拌1次),用脱脂棉过滤。得到的滤液即为酶液。4.3试样溶液的吸光度4.3.3计算X=A×K×8/2×1/10×N×E式中X:样品的酶活力(u/g或u/mL)A:试样溶液的平均吸光度K:吸光常数8:反应试剂的总体积(mL)2:吸取酶液2.00mL,以1mL计1/10:反应时间10min,以1min计N:稀释倍数E:紫外法与福林法的换算系数(酸性蛋白酶系数为0.77)5结果与分析根据作图与回归方程Y=λX,求得λ=0.00755,当吸光度A为1时,K值为132.45,这符合要求的范围。5.2酶溶液中的a值和酶的活性5.2.1仅在不同条件下检测到过滤纸的数据5.2.1.1.采用定量低速过滤纸过滤反应溶液的实际吸收值a和酶活性5.2.1.不同浓度微孔滤膜的蛋白酶活力不同的滤纸来过滤测得的A值数据来分析,滤纸的孔径越小相对于空白的A值与酶液的A值也都小些,但蛋白酶活力基本上是差不多的。样品1用微孔滤膜的蛋白酶活力高。而样品2却是用中速一般滤纸的高一些。这我想可能是测定时的误差造成的。5.2.2不同麦曲线的检测5.2.2.色麦曲蛋白酶活力从5.2.2.1手工麦曲色泽不同检测的蛋白酶数据来分析灰白色的麦曲蛋白酶活力最高,而黑色麦曲蛋白酶活力最小。白色麦曲蛋白酶活力在中间,从这一点上也符合日常老技工们所说的生麦曲,曲块呈白色是放潮不够的表现,麦曲块呈黑色(俗称烂曲),是水分过多的结果。这些麦曲都不是好曲。可见老前辈们传下来的话确实是正确的,它们符合科学依据。这也是实践出真知的表现。5.2.2.不同加工工艺对麦曲蛋白酶活力的影响从5.2.2.1手工麦曲色泽不同检测的蛋白酶活力与5.2.2.2三组手工麦曲与机械化麦曲的蛋白酶活力两表的检测数据中可知,正常的机械化麦曲与正常的手工麦曲相比较,相对而言,手工麦曲的蛋白酶活力稍高一些。这是因为制曲工艺不同造成的。手工曲是靠人力踩的,麦曲的受压程度肯定比机械化曲小,所以手工曲比机械化曲来得松些,优化了菌体生存的空间与条件,这更有利于菌体生长与繁殖。6不同浓度的生麦曲中其总蛋白水平在做多时间差的原因手工生麦曲的蛋白酶活力比机械化生麦曲的蛋白酶活力高,在手工生麦曲中黑色生麦曲与白色生麦曲的蛋白酶活力相对比灰白色的生麦曲蛋白酶活力低。用不同的滤纸来过滤对蛋白酶活力影响是有的,但不是很大。用紫外分光光度法来测量黄酒麦曲中的蛋白酶有着很大的误差,因为以上的几个数据,我是连续做了好几次平行试验才得到的。造成这种误差的原因是:本身黄酒麦曲中蛋白酶含量不是很高。再加上测定时,紫外分光光度计、水解温度、反应时间、吸量都存在着一定的误差。记得有一次我只用一只样做三只平行,而且用微量吸样器吸样,温度基本上是一致的,但在测A值时,三个数据中也有一个测定值之差超过3%。这原因我想主要是在反应时间上,它们总有点时间差的,而且紫外分光光度计也有点仪器误差。从这点可知测量生麦曲的蛋白酶活力,它的误差是相对大的,检测时一定要十分注意。2.5.1称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,精确至0.0002g,用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL,即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。2.5.2吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL,用0.1mo