基于sry基因序列的牛珠蛋白pcr体系的建立

基于sry基因序列的牛珠蛋白pcr体系的建立

随着胚胎移植技术在牛育种中的普及，对牛早期胚胎的性别鉴定已成为控制后代性别的有效方法。在胚胎性别鉴定方法的研究中,H-Y抗原法、荧光原位杂交法(FISH)等由于其时间长、费用高等因素,很难得到广泛的推广应用。多聚酶链式反应(PCR)因其快速、灵敏、准确等优点,故在牛的胚胎性别鉴定中得到了普遍应用[4,5,6,7,8,9,10,11,12,13]。在目前常用的牛胚胎性别鉴定PCR法有常规PCR法和巢式PCR法等,由于巢式PCR的2次扩增效应,使用微量的模板即能获得大量PCR产物,大大增加了扩增的效应及灵敏度。因此,在本试验中,笔者根据牛SRY基因序列自行设计了2对嵌套式引物作为公牛特异性引物,同时根据牛β珠蛋白基因(HBB)序列设计了1对引物作为内参照引物,建立了巢式PCR反应体系,并以微量的卵母细胞和精子细胞为模板对该反应体系的灵敏性进行了检验,以期建立牛早期胚胎性别鉴定的方法。1材料和方法1.1个人麻黄汁液1例随机从武汉开隆牛场选择50头母牛,前腔静脉采血5mL,EDTA抗凝,-20℃保存备用。公牛精液共30份,取自湖北省畜牧局种公牛站,-20℃保存备用。从武汉某屠宰场刚屠宰的母牛体内取出卵巢,保存在装有37℃无菌生理盐水的保温瓶中带回实验室,在倒置显微镜下从卵泡腔内吸出单个卵母细胞。精子细胞取自由湖北省畜牧局种公牛站所得到的新鲜精液。1.2核酸蛋白浓度测定PCR仪(德国Biometra公司)、BIO-RAD凝胶成像系统、核酸蛋白浓度测定仪(德国Biochrom公司)、倒置显微镜(日本尼康2000E型)。TaqDNA聚合酶(北京天为时代有限公司)、dNTP(武汉凌飞有限公司)、蛋白酶K(上海生工生物工程技术有限公司)。1.3从样本中提取dna11提取牛血液中的dna参照文献,将所提取的DNA用TE溶解后,经核酸蛋白浓度测定仪测定浓度,并稀释到100ng/μL,-20℃保存备用。2dna提取方法取200μL新鲜精液于1.5mL离心管中,8000r/min离心5min,去除上清液。向精子沉淀中加入320μL双蒸水,80μL精子提取液[Tris-HCl50mmol/L(pH8.0),EDTA-Na50mmol/L(pH8.0),NaCl500mmol/L,DTT38.9mmol/L,10%SDS(m/V)16μL],100μL蛋白酶K(10mg/mL),37℃消化过夜。DNA提取方法参照文献。同样将提取的DNA用TE溶解后,经核酸蛋白浓度测定仪测定浓度,稀释到100ng/μL,-20℃保存备用。3pcr检测煮沸法:将卵母细胞或精子细胞用无菌超纯水冲洗3次后,放入0.5mLPCR管中,加入10μL无菌超纯水,100℃煮沸10～15min,立即置于冰上冷却,离心后取上清液进行PCR检测。1.4牛珠蛋白基因关联引物的合成根据Genbank上所给出的牛SRY序列设计了2对巢式PCR引物(SRY1和SRY2)作为性别鉴定中的公牛特异引物,同时根据牛β珠蛋白基因序列设计了1对引物作为内参照引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。各引物信息如表1所示:1.5pcr扩增反应1pcr检测dntp、taqna表达扩增体系为20μL,其中10×PCRBuffer2μL,MgCl2浓度2.5mmol/L,dNTP浓度4mmol/L,TaqDNA聚合酶(2.5U/μL)2U,各引物浓度0.2μmol/L,DNA模板100ng。反应程序:95℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,34个循环结束后,72℃延伸5min。反应产物4℃保存。2sry基因外引物pcr扩增第1次扩增体系为20μL,其中10×PCRBuffer2μL,MgCl2浓度2.5mmol/L,dNTP浓度8mmol/L,TaqDNA聚合酶(2.5U/μL)2U,SRY基因外引物SRY1和内参照引物HBB,各引物浓度0.2μmol/L,反应程序与常规PCR扩增相同,20个循环结束后,取第1次PCR扩增产物4μL作为第2次扩增模板,同时加入SRY基因内引物SRY2和内参照引物HBB,各引物浓度0.2μmol/L,其他参数与第1次扩增体系相同,共进行34个循环。1.6检测方法取4μLPCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭(EB)染色,凝胶成像系统检查并拍照。2结果与分析2.1各引用材料的特异性试验结果1内引用的sry2是2号的扩展结果以所提取的DNA为模板扩增结果如图1,所有公牛都能扩增出1条219bp的清晰目的带,而母牛则没有,说明该扩增片段为公牛所特有。2pcr扩增hbc分别以血液DNA及精液DNA为模板进行HBB扩增,结果如图2显示,2种模板都能扩增出1条558bp的片段,表明所扩增的该HBB片段为公母牛所共有。2.2设置内参照基因pcr扩增进行巢式PCR扩增时,首先用SRY外引物SRY1和内参照引物HBB进行第1次扩增,然后以第1次产物为模板,利用SRY内引物SRY2和内参照引物HBB进行第2次扩增,结果如图3所示,所有的公牛DNA样本都能扩增出1条558bp的内参照基因扩增带和1条219bp的SRY内引物扩增带,而母牛DNA样本只能扩增出1条558bp的内参照基因扩增带。同样对所有的30份公牛DNA样本和50份母牛DNA样本进行检测,结果与实际性别都一致,其正确率为100%。2.3精子细胞的扩增为检验所建立的巢式PCR反应体系的灵敏性,笔者以不同数量的卵子及精子细胞为模板进行了扩增反应,结果表明,10个细胞即可准确检验(图4),因此在对胚胎进行性别鉴定时只需少量的细胞即可以进行性别鉴定,从而尽可能减少了对胚胎的损伤。3巢式pcr检测细胞系统的初步检测对牛早期胚胎进行性别鉴定和选择,可以极大提高养牛行业生产效益(如产奶)和经济效益,但这需要建立一种准确、快速、易行的鉴定方法。而PCR法由于具有准确、灵敏、简单易行等优点,使其成为较为理想的胚胎性别鉴定方法。我们在对微量细胞进行巢式PCR检测的同时,也利用常规PCR方法进行了检测试验。虽然常规PCR检测的时间相对较短,但以相同数目的微量细胞为模板进行检测时,由于常规PCR一次扩增产物量较少,很容易在琼脂糖检测时因其扩增带很弱或者亮度不够而产生误判。而相比之下,巢式PCR由于经过2次扩增,扩增产物的量明显增加,结果也更容易判断,而且巢式引物的使用增加了扩增产物的特异性,提高了准确度,整个过程也只需3h即可完成。经试验表明,本试验中所利用的2对SRY嵌套式引物,完全是公牛所特有的。如果只采用这2对公牛所特有的引物进行扩增,若有