2起食物中毒中副溶血性弧菌基因特征分析

2起食物中毒中副溶血性弧菌基因特征分析

嗜盐细菌（vp）广泛分布于生活在太平洋、鱼类、其他矿产、食品和外部环境中。由于它喜欢盐，它对温度有很大的影响。副溶血性弧菌是导致人类急性胃肠炎的重要病原菌,尤其在沿海地带,它是细菌性食物中毒的重要病原菌。以往食物中毒检测时存在着同1份病例或食品样本中分离到的副溶血性弧菌往往有几个血清型的状况,但这些血清型之间是否存在遗传相关性,是否属于同一克隆组(clonecomplex),目前较少资料报道。1996年后O3:K6在全世界范围内流行,并出现了O4:K68、O1:K25、O1:KUT等脉冲场凝胶电泳(PFGE)图谱与O3:K6十分接近的菌株,形成了O3:K6克隆群,被称为大流行株(pandemicstrain),与1996年以前的O3:K6菌株在toxRS基因上有7个碱基的不同,根据这一不同,GS-PCR方法被创建起来,用于区分新旧O3:K6克隆群。orf8可能编码1种粘附蛋白,能增加副溶血性弧菌粘附于人类肠道细胞的能力或增加了其粘附于海生植物表面的能力,也是大流行株的判断标志之一。副溶血性弧菌临床分离株多数可产生1种耐热直接溶血素(TDH),可以裂解我妻氏血平板上的红细胞,产生溶血环,是目前所知的副溶血性弧菌主要的毒力因子,另外一种TDH相关溶血素TRH被认为与脲酶的产生有关,也被认为是副溶血性弧菌的毒力因子之一。资料显示,多数临床分离株携带tdh基因,不携带trh基因。本文从血清学分型、毒力基因携带情况(tdh和trh基因)、大流行株判断(GS-PCR和orf8基因阳性)、PFGE分型等多方面分析,对2起食物中毒中相同样本不同血清型的副溶血性弧菌进行基因特征分析。1材料和方法1.1材料表面1.1.1该菌株的来源1.1.3主要设备和分析软件1.2方法1.2.1抗虫菌的副溶血鉴定1.2.2中毒基因检测1.2.3g-pcr和或f8基因检测1.2.4PFGE2结果2.1生化鉴定结果第2起食物中毒共采集到12份样本,经过分离培养,每份样本挑取10个可疑菌落,共挑取120个可疑菌落进行生化和血清学鉴定,其中副溶血性弧菌80株,其中O3:K644株,O4:K8、O11:K36、O11:K19各10株,O1:K566株,非副溶血性弧菌40株,见表3。2.2遗传因子和trh2.3基因或gs-pcr和f8的随机性2.4pfga的结果2.4.1第一位中毒的pfga的结果2.4.2第二种是中毒的pfga的结果2.4.32.o3：k6中毒的pfga3水煮鱼体内各基因共感染试验本研究中同1份食品样本最多分离到3种血清型的副溶血性弧菌,同1份肛拭中最多分离到2种血清型,说明副溶血性弧菌是多血清型混合存在于食品和感染者身上,如果仅挑取1个可疑菌落容易造成漏检。以第1起食物中毒为例,共有17个不同的血清型(不同样本中血清型个数相加),如果每份标本仅挑取1个可疑菌落,将分离到11个血清型,血清型漏检率35.3%(6/17),以此类推,如果每份标本分别挑取2、3、4、5个可疑菌落,将分离到11、13、14、16个血清型,血清型漏检率分别为35.3%(6/17)、23.5%(4/17)、17.6%(3/17)、5.8%(1/17),只有每份标本挑取12个可疑菌落,才能分离到目前已知的所有血清型,综合成本-效益分析,本研究认为每份样本可以考虑挑取5个可疑菌落。本研究发现,副溶血性弧菌是多血清型混合存在于食品和感染者身上,那么,相同样本中分离的不同血清副溶血性弧菌是否有遗传关系,其遗传特征是否一致?现对基因特征分析如下。第1起食物中毒中,3份肛拭子中(1-8,1-9,1-10)同时检出O3:K6和O2:K28。结果显示,O3:K6携带tdh基因,不携带trh基因,GS-PCR和orf8基因阳性,属大流行株,O2:K28不携带tdh和trh基因,GS-PCR和orf8基因阴性,不属于大流行株。PFGE显示O3:K6和O2:K28有7个以上条带变化,根据Tenovar原则,O3:K6和O2:K28为遗传不相关菌株。水煮鱼(1-3)分离到3种血清型的副溶血性弧菌,O2:K28,O3:K25和O4:K12,它们不携带tdh和trh毒力基因,GS-PCR和orf8基因阴性,PFGE显示,3种不同血清型的菌株有7个条带以上的变化,为遗传不相关菌株。第2起食物中毒中,餐盘涂抹样(2-5)和肛拭子(2-6)都检出O3:K6和O1:K56,O3:K6和O1:K56都携带tdh基因,不携带trh基因,但O3:K6的GS-PCR和orf8基因阳性,属大流行株,O1:K56的GS-PCR和orf8基因阴性,不属于大流行株,PFGE显示O3:K6和O1:K56有7个以上条带变化,为遗传不相关菌株。就本次研究显示,来自相同样本不同血清型的副溶血性弧菌属于不同克隆,为遗传不相关菌株。第1起食物中毒中,食品(1-1、1-2、1-3)和肛拭(1-8、1-9、1-10)中都分离到O2:K28,它们都不携带tdh和trh基因,GS-PCR和orf8基因阴性,且PFGE带型基本一致,属于高度相关菌株。结合流行病学资料,可以证明患者是食用了该食品受到感染。虽然O2:K28不携带tdh和trh毒力基因,但细菌的大量繁殖也会导致腹泻等症状,或者O2:K28有尚未发现的致病因子。即使每份样本挑取20个菌落,仍然不能找到病人肛拭中O3:K6的感染来源,说明单纯靠多挑可疑菌落是不行的,或者感染来源并不限于这3种食品,还有其他感染来源未找到。另一原因可能是,非O3:K6菌株进入人体后,发生了基因水平转移,转变成O3:K6。Bhoopong等发现6株副溶血性弧菌分别在小鼠体内传代50次,其中有3株菌从O11:KUT转变成O11:K15,但毒力不发生改变,而在体外传代50次,血清型和毒力都不会发生改变,说明副溶血性弧菌在体内复制过程中血清型的变异是可能发生的。第2起食物中毒中,从卤鸡蛋盘涂抹样(2-5)中分离到了O3:K6和O1:K56,与病例分离的O3:K6和O1:K56各有1条带的差异,属高度相关菌株,推测是本次食物中毒的污染源。肛拭子(2-10)分离到O4:K8,携带tdh毒力基因,不属于大流行株,推测属于不同传染源的感染。O11:K36携带tdh毒力基因,GS-PCR和orf8的结果显示属于大流行株,PFGE显示,与O3:K6有5条带的差异,为可能相关菌株。卤鸡蛋(2-1)中分离到的O11:K19,不携带tdh和trh基因,不属于大流行株,PFGE带型与O3:K6、O4:K8等也不一致,属于不相关菌株,不能证明与本次食物中毒有关。综上所述,前后2起食物中毒分离的O3:K6都是tdh阳性、trh阴性、GS-PCR和orf8阳性,PFGE带型一致,属于大流行株。沙门菌H9812,作为PFGE的分子量标准,由中国疾病预防控制中心传染病所惠赠。1.1.2血清型菌株的筛选和pfge分析副溶血性弧菌琼脂(上海市疾病预防控制中心),副溶血性弧菌诊断血清(日本生研株式会社),SeaKemGoldAgarose(美国CambrexBioScienceRockland),XbaI、NotI限制性内切酶(大连宝生物公司),蛋白酶K(上海生工),一步法PCR试剂盒(上海生工)。VITEKDENSICHEK浊度仪(法国BioMérieux公司),恒温水浴摇床(英国GRANT公司),脉冲场凝胶电泳仪(美国Bio-RadCHEFMapper),凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司),BioNumerics图像分析软件(比利时)。第1起食物中毒发生在2010年5月17日深圳市南山区某电子有限公司食堂,员工用餐后发生腹泻、腹痛症状,感染人数有20人左右,采集到病人肛拭子9份,可疑食品3份,按照GB/T4789.7—2008食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验的要求,分别接种3%NaCl碱性胨水,37℃培养18h,划线副溶血性弧菌琼脂,37℃培养24h,每个平板上挑取20个可疑菌落,进行盐耐受试验、生化试验和血清学鉴定。第2起食物中毒发生在2010年7月1日深圳市南山区某配餐中心,客人用餐后发生腹泻、腹痛症状,感染人数有10人左右,采集到病人肛拭子7份,可疑食品2份,涂抹样3份,经过上述相同的步骤,每个平板上挑取10个可疑菌落。参考文献进行。每份样本挑选不同血清型的菌株各1株,水煮法提取DNA,采用多重PCR扩增tdh和trh基因。引物见表1。参考文献进行。采用1.2.2中提取的DNA,进行以下试验。GS-PCR在25μL反应体系中进行:5μLDNA,12.5μL2×PCR缓冲液,引物各0.25μL(10mmol/L),以及7μL灭菌蒸馏水。反应条件:96℃预变性5min,96℃变性1min,45℃复性2min,72℃延伸3min,25个循环,最后延伸72℃7min。引物见表1。参考文献进行。从2起食物中毒中挑取代表菌株,每份样本的每种血清型至少1株,进行PFGE。采用40U限制性内切酶NotI于37℃酶切4h。H9812用XbaI50U37℃酶切2h作为分子量标准。电泳参数:电压6V/cm,电场夹角120°,起始转换时间10s,终末转换时间35s,电泳18h。用凝胶成像软件Quantityone-4.4.0获取图像,BioNumerics4.0分析图像,聚类分析采用非加权组平均法(unweightedpairgroupmethodwithaverages,UPGMA)方法和Dice系数,按tolerance1.5%,optimization1.5%绘制聚类图。第1起食物中毒共采集到12份样本,经过分离培养,每份样本挑取20个可疑菌落,共挑取240个可疑菌落进行生化和血清学鉴定,副溶血性弧菌和非副溶血性弧菌分别为180和60株,其中O3:K6107株,O2:K2870株,O4:K34、O3:K25、O4:K12各1株,见表2。第1起食物中毒中,11份样本中挑出17株菌进行毒力基因检测,分别是8株O3:K6、6株O2:K28、1株O4:K34、1株O3:K25、1株O4:K12,结果显示,8株O3:K6携带tdh基因,不携带trh基因,其他血清型tdh和trh基因都不携带,见图1。第2起食物中毒中,8份样本中挑出10株菌进行毒力基因检测,分别是5株O3:K6、2株O1:K56、1株O4:K8、1株O11:K36、1株O11:K19,结果显示,除O11:K19不携带tdh和trh基因外,其他9株菌都携带tdh基因,不携带trh基因,见图2。第1起食物中毒中,8株O3:K6GS-PCR和orf8基因阳性,其他血清型GS-PCR和orf8基因阴性(图1)。第2起食物中毒中,5株O3:K6和1株O11:K36GS-PCR和orf8基因阳性,其他血清型GS-PCR和orf8基因阴性(图2)。第1起食物中毒中,3份食品样和3份肛拭子均分离到O2:K28,PFGE显示,其中5株O2:K28的带型一致,1株O2:K28(1-10-3)的带型与其他5株不一致。8份肛拭子中都分离到O3:K6,PFGE带型一致,O3:K6与O2:K28、O4:K12、O3:K25的带型均不一致,见图1。其中O4:K34由于复苏时污染,未做PFGE。