端粒长度对细胞增殖能力的影响

端粒长度对细胞增殖能力的影响

段粒是线性真核细胞染色体的自然末端，与细胞的生存化和细胞的衰老有关。人胚胎细胞可以表达端粒酶并维持稳定的平均端粒长度,其最初端粒长度可以确定体细胞的复制性寿命。在体细胞内,常常无端粒酶活性,端粒重复序列会随每次细胞分裂而渐进性丢失,最终使染色体完整性丧失,细胞增殖停止。这说明端粒的缩短与高等真核生物中正常体细胞增殖的限制相关,这种有限的细胞分裂能力已经在许多实验中得到证实。材料和方法1.皮肤正常皮肤和正常嘴唇腺的检测老年组年龄60岁至70岁;婴幼儿组年龄范围在出生后3个月至2.5岁。老年组正常皮肤表皮有27份,均来自颌面部整形手术及因肿瘤、外伤后而进行的整复术所切除的正常皮肤;婴幼儿组正常皮肤表皮有30份,来自唇裂整复术及其他手术所切除的正常皮肤。老年组正常腮腺30份,均来自多形性腺瘤手术摘除的部分正常腮腺;婴幼儿组正常腮腺21份,均来自腮腺血管瘤手术而摘除的腺体,每组性别不限。2.案件间杂交信号加强和分子鉴定参考Hiyama方法进行测定。常规方法提取DNA,用适量HinfI,在37℃下彻底酶切1小时。取一定量已酶切的DNA在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳,然后转膜至硝酸纤维素滤膜上,经预杂交后,再与[r-p32]-dATP标记的探针(TTAGGG)4进行Southern杂交,再进行放射自显影,比较每条泳道上位于15kb-1kb间杂交信号最强的位置区域。经HinfI酶切的DNA产生了含有完整的端粒重复序列的末端限制酶切片断及一部分含有TTAGGG样序列的亚端粒DNA片断。由于一块组织中含有大量细胞,每个细胞中的端粒长度是不同的,变化较大。Southern杂交信号最强处实际上是TTAGGG含量最丰富处。每个DNA片断所含端粒重复序列的数量是与DNA长度相应的,因此,我们参考前人的实验方法并做一些改变,将杂交信号最强区域的中间带处的DNA长度作为每份标本的端粒限制性片断长度。通过TRF值间接测得近似的每份标本的端粒长度,然后计算每组平均TRF值,并对结果进行统计学分析。HinfI酶及(TTAGGG)4探针由大连宝泰克生物公司合成,[r-p32]-dATP由北京亚辉公司提供。皮肤表皮trf长度的变化每份样品的杂交信号都在一个较宽的范围内分布(15kb-1kb),由杂交信号较强的沫迹和杂交信号较清晰条带组成。沫迹是由含有端粒样结构的亚端粒与探针杂交所致;而清晰的条带是由端粒本身重复序列与探针杂交所致。同一年龄组中,不同组织的平均TRF长度是不同的。在婴幼儿组中,皮肤表皮的平均TRF长度为9.46±0.64kb;而腮腺的平均TRF长度为8.8±0.44kb。在老年组中,皮肤表皮的平均TRF为8.20±1.22kb;而腮腺的平均TRF为8.62±0.64kb。在婴幼儿组中,每份皮肤表皮TRF值及腮腺标本TRF值分布较平均;而在老年组中,每份表皮TRF值和每份腮腺TRF值的分布不十分匀称,有4份表皮TRF短于5.5kb,5份表皮TRF长于8.5kb,有3份腮腺TRF短于5.5kb。在两个不同年龄分组中,皮肤表皮的TRF平均值随年龄增长而呈下降趋势,表现出从总体趋势上与年龄有关。而腮腺腺体的TRF平均值不随年龄增长而出现变短趋势。两个不同年龄组中的表皮TRF平均值间均有显著性差异;而腮腺腺体TRF平均值间无统计学意义。皮肤表皮trf含量的变化细胞衰老的端粒假设理论是由Olovnikov首先提出,他认为人体细胞染色体长期稳定依赖于端粒重复序列的增加,端粒酶活性存在于胚胎细胞中,但在多数体细胞中则无。由于末端复制问题,正常体细胞染色体会随细胞的每次分裂而有一段端粒重复序列丢失,体细胞中染色体渐进性缩短可导致重要基因丢失,经过有限次分裂后端粒缩短至某一关键区时,启动了生长停滞信号引起细胞分裂停止,细胞退出细胞分裂周期而衰老死亡。因此,有学者提出正常人体细胞端粒长度可作为衡量细胞有丝分裂能力的“生物钟”,其机理目前不十分清楚。大量实验证明在培养的成纤维细胞及其他在体体细胞中,包括皮肤表皮细胞、外周血白细胞及结肠粘膜上皮细胞,随供体年龄增长,均有有端粒缩短发生。我们测定了不同年龄供体正常颌面部皮肤表皮细胞中的TRF,发现随年龄增长,TRF值降低。细胞端粒缩短是控制细胞寿命的主要原因。皮肤表皮是生理功能较旺盛的组织,在人的一生中不断更新,其更新速率较快。表皮的增殖是靠其增殖单位内的干细胞-中央基底细胞的衍生而来。老年人皮肤有以下特点:再生能力较低,分裂旺盛的细胞成份少,衰老角化的细胞多,皮肤表皮生理性脱落缓慢,角化层变厚,多倍体细胞数量增多及老年人易患皮肤癌;而婴幼儿皮肤表皮中分裂旺盛的细胞成份多,表皮的更新生理性脱落速度快,衰老、角化的残留细胞少,因此老年组皮肤表皮细胞的TRF均值比婴幼儿组皮肤表皮的TRF均值低,有显著性差异,本文结果也证实了这一点。在两个不同年龄组的腮腺中,末发现老年组的腮腺TRF均值比婴幼儿组的TRF均值显著降低。在不同组织中,随年龄变化,两组的平均TRF表现出完全不同的趋向。我们推测这种不同是由端粒长度调节基因所致,不同组织的TRF长度是分别独立自身调节的。腮腺组织也是靠干细胞的分裂来更新,但是腮腺内干细胞的分裂次数很少,其组织更新率不象皮肤表皮那样快,因此,干细胞一旦分化成为腺泡细胞后,具有极长的生命期,其分裂周期长而缓慢,结果,其平均TRF长度随年龄增长不会出现明显的缩短,除个别实验对象会表现出明显的TRF缩短,但从总体上,其TRF均值间无显著差异。这种不同组织TRF值的差异是由于两种组织不同的生理性质及其细胞分裂能力决定的,不是由年龄决定的。老年组部分腮腺组织TRF值降低,除可能与个体差异有关外,可能还与全身或局部疾病相关。细胞倍增数量的降低,很可能反映出不同年龄供体体内细胞复制潜能的降低。这提示体细胞中的端粒长度与供体年龄相关性不大,而是细胞复制潜能的指标。Allospp也证明TRF长度是体细胞复制能力的最好指标。另外,还有实验证明端粒长度及细胞的复制能力在早老性病人的成纤维细胞中均有降低。这进一步说明端粒长度是细胞衰老的生物指标,而不是供体年龄的指标。实验中所测的TRF值是细胞群体的平均TRF,平均TRF的计算应保证所得的平均TRF值内的TTAGGG重复序列的量与所测得值的长度相适宜。由于没有一个可靠的直接测量端粒长度的方法,人们常用平均TRF长度来检查末端重复序列的长度变化,而且端粒序列的丢失常常伴随杂交信号强度的降低。所以,本实验在参考前人的实验方法同时,做一些修改,取杂交信号最强区的中间位置作为TRF值的测量标准,以便能更近似正确地表达出每份样品的端粒长度。另外,由于不同端粒中非TTAGGG成份的长度不同,以及在TRF附近区域中有TTAGGG的存在,导致端粒探针可以与4-5kb以下的某些TRF杂交,故每份标本的杂交信号分布范围较广。对于多种有机体来说,端粒重复序列的数目不同,导致端粒长度不均一。不同种类的细胞,其端粒长度有着明显的不同。控制端粒长度的决定因素是对端粒特异的DNA聚合酶,即端粒酶。端粒长度的维持靠多水平的调整,除端粒酶外,还有端粒结合蛋白,双链和单链端粒结合蛋白调整端粒酶通向染色体末端的途径,从而影响细胞分裂周期、生长及发育。最近Bryan等发现40%的永生化细胞无端粒酶活性,但这些细胞具有很长且长短不一的端粒,其详细