【荧光酶免疫在临床中的应用研究4100字】

荧光酶免疫在临床中的应用研究综述报告目录TOC\o"1-2"\h\u28376荧光酶免疫在临床中的应用研究综述报告 1130741荧光酶免疫分析 1236232荧光酶免疫的临床应用 351652.1材料 3210822.2FEIA检测方法 394432.3结果 325682.4讨论 4308593酶免疫分析的局限及发展趋势 530365参考文献： 6摘要：酶免疫分析是标记免疫分析中的一项重要技术，是以酶标记的抗体作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术作为经典的三大标记技术之一。酶免疫技术在临床医学中得到广泛应用并不断得到更新，不断和其他先进技术如荧光、发光技术以及仪器自动化相融合，在临床中的的应用也越来越频繁。基于此本位以荧光酶免疫在临床中的应用为主题进行了探讨，对荧光酶免疫主题的内容进行了进一步的深入思考。关键词：荧光酶；临床；免疫1荧光酶免疫分析荧光酶免疫分析即在普通的酶免疫分析的基础上，用理想的酶荧光底物代替显色底物，可提高检测的灵敏度，扩大检测范围，减少各种试剂和样品。这一剂量已成为酶免疫测定的微敏感方法。荧光底物的理想条件是:(1)稳定性:贮存期稳定，在适当条件下贮存时间长，不超过酶解荧光产物。这种酶起作用快一些。(3)产品稳定，具有较强的荧光性。(4)宽的Stokes位移，并倾向选用激发光波长较长者，因低能量的激发产生较低的荧光本底。目前对酶免疫分析常用的三种酶POase、APase及BGase都有相应的荧光底物。下表中列出文献报道的用不同底物酶免疫分析的灵敏度限值。由该表可见应用三种酶的荧光酶免疫分析的灵敏度都明显高于普通的酶免疫分析。表1表应用不同底物酶免疫分析的灵敏度限值底物检测体系检测限值APase4-硝基酚磷酸酯(NPP)光度测定10000amol4-NPP光度测定50amol4-MUP荧光测定0.5amol4-MUP荧光测定lamol/lOOminPOase(HRPOase)邻苯二胺(OPD)光度测定25amol/min4-羟基苯乙酸荧光测定2amol/min3-(4-羟基苯)丙酸荧光测定0.03amol/min荧光素(luciferin)发光测定0.125amolBGase2-硝基酚-P-D半乳糖甘光度测定lOOamol/min(ONPG)4-MUG荧光测定0.003amol/min注:amol,即atomol,为l0-18mo］早期荧光素酶免疫测定没有专门的辅助仪器。反应后，样品需要移动到一个测量杯，用荧光计测量。目前荧光免疫分析仪器中通用的测量仪器较少，分析方法与仪器之间存在很强的依赖性。大多数放射免疫分析和普通酶免疫分析是通用的，仪器制造商通常不生产相应的检测试剂盒。目前，随着96孔板中酶免疫分析方法的应用越来越广泛，出现了多种通用酶免疫分析阅读器(reader)，针对各种酶的常见底物的波长滤光片也不断出现。荧光素酶免疫分析法是在常规酶免疫分析法的基础上发展起来的。随着96孔板的广泛应用，有必要建立一种通用的96孔板荧光素酶免疫分析方法。实际上，已有该类仪器生产，如TecnosumaInternational生产的双用的PR-52196孔板测量仪(dualplatereader,pho-tometerandfluorometer),就备有两套光源，既可用于酶免疫分析又可用于荧光酶免疫分析。后者使用的96孔板是一种白色不透明塑料板，有助于反射和收集发射的光。为了减少荧光背景，黑色不透明塑料板也可以用来反射和收集发射的光。黑色不透明塑料片也可以用来减少荧光背景。综上所述，荧光素酶免疫分析是一种灵敏度高、测量范围宽的分析技术，但应特别注意避免荧光分析中最常见的问题，即荧光背景增强。因此，除设计荧光测量仪本身外，还应特别注意分析:各种试剂的纯度和清洁度，荧光底物的纯度和保存度，荧光底物加入后的适当孵育时间的确定，以及避免外部来源。荧光材料的污染和清洗的彻底性。2荧光酶免疫的临床应用2.1材料（1）正常血标本∶取自北京地区出生后72h的正常新生儿足跟血，吸于特制的滤纸上，呈直径10mm血斑，自然干燥后备用，共1794份。（2）质控品∶美国疾病控制中心（CDC）提供的筛查用TSH滤纸干血片质控品。（3）试剂及设备;芬兰Labsystems公司提供FEIA法筛查用TSH试剂及荧光读数仪等设备。ELISA及IRMA法试剂分别由美国GBI及DPC公司提供。2.2FEIA检测方法用直径3mm打孔钳，在滤纸干血片上（包括标准品、质控品、及被测样品）打2个血片，分别置包被板孔中，加入酶标记抗体（1∶100稀释），900次/min振荡2h后，弃掉孔中纸片及液体，用1∶10冲洗液冲洗4次，再加入200ml荧光底物;室温振荡lh后，加入100ml终止液，在320nm/405nm波长下进行荧光比色，以机载软件处理TSH含量检测结果。2.3结果2.3.1精确性;（1）批内变异系数（CV）∶以该试剂盒提供的B、D、F3个TSH标准品作为TSH低、中、高含量的被测物，批内重复测定16次，其均值十标准差和批内变异系数如下∶标准品B为491＋35，CV0.072;标准品D为1889＋180，CV0.095;标准品F为3735＋273，CV0.073。批内平均CV为0.080。（2）批间CV∶取本试剂盒提供的TSH低值和高值质控品，于不同试验批次内测定8次，统计CV值，低、高质控CV值为0.120和0.092，平均CV为0.110。2.3.2准确性∶取CDC提供的高、中、低3个TSH含量质控品，每浓度重复3次，其重现率见表1。表23种方法检测TSH质控品的重现率样品TSH含量次数理论值测定值（mIU/L）重现率（%）FEIAELISAIRMAFEIAELISAIRMA低32525.423.929.9101.695.9119.6中34038.641.242.796.5102.9106.7高38072.980.783.591.1100.9104.42.3.3灵敏度：以该试剂盒的A、B2个TSH标准品分别检测3次，按传统灵敏度检测方法，依吸光度值（A）的x±3s统计最低检测限为4.14mIU/L。2.3.4FEIA、ELISA、IRMA方法的相关性∶用3种方法检测同一组72份新生儿血标本TSH含量，试验结果做统计学相关性处理，FEIA方法与EISA和IRMA方法相关系数r分别为0.9698和0.9756（P<0.001)。2.3.5新生儿筛查中TSH切值的选择∶对1794份新生儿血标本中的TSH使用FEIA法进行检测，其频数分布情况见表2。表31794例新生儿TSH含量频数分布状况分组(mIU/L)频数(n)人群百分率（%）分组(mIU/L)频数(n)人群百分率（%）0〜26814.9412〜30.171〜35619.8413〜10.062〜41523.1314〜30.173〜27615.3815〜00.004〜18010.0316〜00.005〜1065.9117〜00.006〜754.1818〜00.007〜502.8719〜00.008〜241.3420〜10.069〜191.0621〜00.0010〜60.3322〜00.0011〜100.5623〜2410.06经统计正常新生儿人群TSH含量呈偏态分布。中位数为2.67mIU/L，高值端99%可信限为11.05mU/L，建议此方法甲低筛查切值（cutoff值）定为12mIU/L。超出者为可疑甲低患儿，需追踪复查。2.4讨论新生儿筛查是提高人口素质的重大举措之一，我国已开展了甲低及苯丙酮尿症(PU)的筛查。筛选方法包括免疫放射测定法、酶联免疫测定法、时间分辨荧光免疫测定法和荧光素酶免疫测定法。20世纪90年代初，Tuminen等报道了用3-o-羟基苯基二乙基酮酸作为底物，通过氧化酶的作用产生高灵敏度的荧光，然后在酶标记的基础上替换原来的荧光底物。显色底物作为荧光强度测定的定量基础。作者认为，这种新型衬底具有较高的灵敏度，为FEIA法的快速发展奠定了基础。作者报告使用该方法筛查新生儿甲状腺功能减退症在同一年。该方法与苯丙酮尿症化学筛查中的荧光强度测定相同，可用于甲状腺功能减退症和苯丙酮尿症的筛查。北京市新生儿TSH水平的99%置信限为11.05mlU/l。甲状腺功能减退患儿TSH升高。建议甲状腺功能减退筛查的临界值为12mlu/l。我们实验室过去用美国产品对同一区域的人进行甲状腺功能减退筛查，阈值一般设定在20mlu/l左右，因为两种标准产品的含量表达不同。实验室系统产品的标准产品使用全血值进行校准。结果表明，该指标低于用血清值校准的美国产品的测定值。此外，我们发现，即使采用相同的技术，不同地区新生儿正常TSH水平也存在差异。如果报道，使用FEIA方法，正常新生儿TSH水平的99.9%的置信限为8.4mIU/L，导致较低的结果。此外，种群中TSH水平分布曲线的峰值低于本组，这可能与种群的区域差异有关。为此，建议根据所选仪器和试剂确定该领域的筛选阈值，以确保筛选开始前的筛选质量。3酶免疫分析的局限及发展趋势(1)酶免疫分析检测的特异性实际上是由单克隆抗体所指向的抗原簇决定的，因此受试剂所使用的抗原和抗体的纯度、特异性、稳定性、特异性和纯度的影响。当然，其他标记免疫方法也有问题，但要注意EIA试剂盒供应商的数量。(2)在酶免疫分析测定结果中目前所测的胰岛素或C肽，近年发现是该物质及其前体的混合物就是受抗体局限的明显例子，是山于有交叉的抗原性而难以分开，因此通带检测的只能称为“免狡反应性脓的素或Ｃ肽，这使行我们需亚新评价过去对所测的脓的素或Ｃ肽的认识，非致力于“真”或“纯脓的蔡Ｃ的测定，类似的情况可能还会发现。（3）酶免疫分析以固相反应为主，在实验中，该聚合物能够填充四相包被抗原的不同部位(抗体不一致引起的农业表面效应，聚合温度和时间避免了侧孔和中心孔反应带的不一致)。一步法比两步法更容易产生钩效应。抗原与抗体比值不匹配引起的边缘效应和钩效应应引起重视。（4）固相材料存在非特异性吸附，标本谐血或冰箱贮存可释放过氧化物酶，冰存时间过长可导致血消聚合甚到严重干扰测定。当然，随着技术的进步和仪器自动化程度的提高，这些缺陷在自动化程度相对较低的仪器和工作量较大的实验室中并不明显，而在半自动仪器和少量样品中则需要放在冰箱中保存，这些不足仍然是明显的。总之，随着科学发展和技术创新，酶免疫分析技术必将越来越完善，自动化程度越来越高，准确度和精密度越来越好，定将为人类的健康事业作出更大的贡献参考文献：[1]ShelverWL,KimHJ,LiQX.Developmentofamonoclonalanti-body-basedenzyme-inkedimmuosorbentassayforthebeta-4-drenergicagonistilpaterol[J].JAgricFoodChem,2005,53(9):3273-3280[2]WuFB,HeYF,HanSQ.Matrixinterferenceinserumtotalthy-roxin(T4)time-resolvedfuorescenceimmunoassayanditseliminationwiththeuseofstreptavidin-biotinseprationtechnique[J].ClinChimActa,2015,308(F2):117-126.[3]张莹，徐文弟.酶联免疫吸附测定法在医学研究中的新进展[J].哈尔滨医科大学学报，2019，344）∶306-308.[4]郭积燕.免疫学检验中的酶免疫技术[J].中华检验医学杂志，2020,28(2):221-224.[5]ZhaoQR,LiMJLiuJetal.Enzyme-amplifiedtime-resolvedfluo-rescencedetectionfornucleicacidhybridizationassays[J].Zhong-guoYXueKeXueYuanXueBao,2002.24(1):84-88[6]YonezawaS.CowalentcouplingofsteroidtomicrowellplatesforuseinCompetitiveenzyme-linkedimmuosorbentassay[J].JIm-munolMethods,2019,166(1):55-61.[7]李振甲.酶免疫分析技术研究进展[J].标记免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