发酵工程制药-发酵染菌及防治

染菌的原因及防治原因很多，归纳起来主要有：一、染菌的原因人为操作不当灭菌不彻底设备渗漏种子保藏不当带菌无菌空气带菌（一）种子带菌的原因及防治培养基及用具灭菌不彻底菌种在移种过程中受污染菌种在培养或保藏过程中受污染1、培养基及用具灭菌不彻底原因灭菌锅内空气排放不完全，造成假压，使灭菌时温度达不到要求。防止方法灭菌时锅内排气完全。2、菌种在移接过程中受污染原因接种时操作不当，或无菌室管理不严。预防方法合理设计无菌室，规范无菌室管理制度，严格进行无菌操作。3、菌种在培养过程或保藏过程中受污染原因菌种在培养或保藏过程中，由于外界空气进入，也使杂菌进入而受污染。防止方法试管的棉塞应有一定的松紧度，不宜太松且有一定的长度；培养和保藏温度变化不宜太大；每一级种子经检查合格后才能使用。（二）无菌空气带菌及防治在好氧发酵中通入的无菌空气带菌是发酵污染菌的主要原因之一原因过滤器失效、空气过滤器质量、高效滤芯的安装质量、无菌空气带油带水预防方法空气净化流程和设备的设计要合理，过滤介质的选用和装填恰当过滤介质的灭菌和管理有效特点批批染菌、罐罐染菌。（三）设备渗漏或设备、管道存在“死角”造成的染菌及防治1、设备渗漏引起的染菌及防治发酵设备、管道、阀门的长期使用，由于腐蚀、磨擦和振动等原因，往往造成渗漏，从而引起染菌。包括：夹套、盘管、接种管穿孔，阀门、搅拌轴、罐盖以及其它设备渗漏等。特点往往每批染菌发生的时间逐渐提前。预防方法选用优质材料，并经常进行检查。2、设备、管道存在“死角”造成的染菌及防治“死角”：由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效充分到达预定的局部灭菌部位，从而达不到彻底灭菌的要求。这些部位即为“死角”。“死角”可以是设备、管道的某一部位，也可以是培养基或其它物料的某一部分。（1）不锈钢衬里破裂形成“死角”；（2）发酵罐底部培养基的沉积污垢形成“死角”；（4）管道转弯处形成的“死角”；（5）法兰连接不当造成“死角”。防治：主要从清洗和灭菌来防治。（四）培养基灭菌不彻底导致染菌及防治原料性状及灭菌技术的好坏影响灭菌质量。1、原料性状稀薄的培养基易灭菌彻底；而淀粉质原料特别是有颗粒时易灭菌不彻底或是升温过快或混合不均时，易结块，使中心部位在灭菌时“夹生”，导致在发酵过程中团块散开而染菌。防止措施：淀粉质培养基以实罐灭菌为好，在升温时先搅拌均匀，加入一定量的a-淀粉酶进行液化，并将原料大颗粒筛去。2、实罐灭菌时未充分排除罐内空气此种情况造成“假压”使罐顶局部温度达不到灭菌要求，导致灭菌不彻底而污染。防止措施：在实罐灭菌升温时，应打开排气阀门有关相连接管的边阀、压力表接管边阀等，达到彻底灭菌。3、培养基连续灭菌时蒸汽压力波动大蒸汽压力波动大，使培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底而受污染。防止措施：培养基连续灭菌时应严格控制灭菌温度，最好采用自动控制装置。（五）操作问题操作不当引起杂菌污染：如移种时或发酵过程，罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖而造成污染；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染等等。防止措施：科学管理，加强技术培训和责任心教育等。二、染菌隐患的处理01严格按操作工艺进行02投产前进行整个发酵系统的无菌测试03加强在线检测技术04定期对设备维修05严格工人的管理三、染菌后处理措施1、染菌培养基须灭菌才可排入下水道否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。2、寻找染菌的原因对症下药，染菌罐彻底清洗，进行空罐消毒。3、车间环境消毒染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。若污染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒。三、染菌后处理措施小结1、染菌的原因：设备渗漏、空气带菌、种子带菌、灭菌不彻底、操作不当。2、染菌后处理措施：发酵液必须灭菌后才可放下水道、寻找染菌的原因、染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒。思考题1.有哪些原因会引起染菌？2.染菌以后应采取什么措施？3.分析题：某发酵厂的第1号发酵罐生产时，连续多次发生染菌事件，且每次污染的杂菌种类基本相同，请分析这种情况下，染菌的原因可能是什么？染菌对发酵的影响发酵过程控制发酵的类型发酵染菌及处理菌种选育成品灭菌培养基的优化种子培养发酵生产产物分离纯化什么叫发酵染菌?在发酵过程中，生产菌以外的其他微生物侵入了发酵液，从而使发酵过程失去了真正意义上的纯种培养。01染菌对不同发酵工艺的影响02杂菌种类不同对发酵的影响03不同污染原因对发酵的影响04不同污染时间对发酵的影响05染菌程度对发酵的影响06染菌对产物提取的影响菌种、培养基、发酵条件、发酵周期以及产物性质等不同，染菌造成的危害程度也不同。一、染菌对不同发酵工艺的影响肌苷、肌苷酸发酵——生产菌是多种营养缺陷型，生长能力差，培养基营养丰富等——易染菌谷氨酸发酵——周期短，生产菌繁殖快，加之培养基不太丰富——极少污染，但噬菌体危害大。柠檬酸发酵——产酸后pH值很低，一般杂菌不易生长——防止前期染菌。总之，无论何种发酵，染菌后都会造成糖及其他营养基质被消耗，而影响发酵产物的合成，使产量大大地降低。二、不同杂菌种类对发酵的影响在工业发酵中，不同种类的杂菌对发酵造成的危害是不同的。青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大链霉素发酵：污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大四环素发酵：污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大柠檬酸发酵：最怕污染青霉菌肌苷、肌苷酸发酵：污染芽孢杆菌的危害最大谷氨酸发酵：最怕污染噬菌体、因为噬菌体蔓延迅速，难以防治，容易造成连续污染。高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大02空气带菌使发酵大面积染菌03培养基或设备灭菌不彻底一般不具延续性，使单个（批）发酵罐发酵失败04设备渗漏染菌几率较大01种子带菌将导致染菌范围不断扩大，使生产蒙受重大损失。三、不同染菌途径对发酵的影响四、不同染菌时间对发酵的影响染菌时间：指无菌检查方法确准的污染时间，不是杂菌进入培养液的时间0102040302发酵前期染菌杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成03发酵中期染菌严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成04发酵后期染菌如杂菌量不大，可继续发酵。如污染严重，可采取措施提前放罐01种子培养期染菌菌体浓度低、培养基营养丰富，最易染菌，且危害最大五.不同染菌程度对发酵的影响染菌程度越大，对发酵的危害就愈大。当生产菌已迅速繁殖，在发酵液中占有优势，污染极少数杂菌(1~2个杂菌/1L)，对发酵不会造成影响，因为这些杂菌需要时间繁殖才能达到危害发酵的程度，而且环境对杂菌的繁殖已不利。但是污染幅度较大时，特别是发酵前期和中期污染，将造成严重的危害。六.染菌对产物提取和产品质量的影响对过滤的影响：02发酵液粘加大，甚至发臭。01菌体大多自溶03由于发酵不彻底，基质的残留浓度增加六.染菌对产物提取和产品质量的影响造成影响：大幅度降低过滤效率过滤时间延长，设备周转率降低解决方法：加热发酵液，加助滤剂或絮凝剂，凝聚蛋白六.染菌对产物提取和产品质量的影响对提取的影响：有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白，易发生乳化，使水相和溶剂相难于分开离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量沉淀法提取：杂质随产物沉淀而影响下游处理工序，影响产品质量六.染菌对产物提取和产品质量的影响对产品质量的影响：对内在质量：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质——产品纯度对产品外观：一些染菌发酵液经过处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现浑浊，影响外观小结1、染菌的概念2、染菌时间3、染菌对发酵影响的六个方面染菌异常现象及处理方法

溶解氧的异常变化一、发酵过程中异常现象判断染菌ⅠⅣⅡⅢ正常的溶解氧曲线Ⅰ发酵初期，溶解氧基本不变Ⅱ对数生长期，溶解氧浓度迅速下降Ⅲ发酵中期，溶解氧有波动但变化不大Ⅳ发酵后期，溶解氧浓度上升异常的溶解氧曲线1、当感染噬菌体时，生产菌的呼吸作用受抑制，溶解氧浓度迅速上升。感染噬菌体时的溶解氧的变化比菌体浓度变化更灵敏。2、当受到非好气性杂菌污染时，抑制生产菌的生长，降低溶解氧的消耗，使溶氧升高。3、污染好气性杂菌时，溶解氧的变化是短时间内下降，直至为零，且在较长时间内不能回升案例

排气中CO2异常变化显示染菌好氧发酵排气中CO2含量与糖代谢有关，发酵工艺一定时，排气中CO2含量变化是有规律的。02污染杂菌，糖耗加快，CO2含量增加。03感染噬菌体，糖耗减慢，CO2含量减少。

其他异常现象菌体生长不良pH值的异常变化泡沫的异常增多代谢异常发酵周期的延长发酵液的粘度异常发酵液颜色异常变化二、染菌的检查检查方法有哪些？革兰氏染色鞭毛染色显微镜检查法

肉汤培养法检查培养基和无菌空气是否带菌或菌种中是否有噬菌体。常用葡萄糖酚红肉汤作为培养基阳性阴性平板划线培养或斜面培养检查法1234倒平板空培养待测样品划线培养观察总结以平板划线和肉汤培养结果为主要根据肉汤连续发生三次变色反应或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。020103无菌试验的肉汤或平板应保存并观察至本批放罐后12h，确认为无杂菌后才能弃去。要定期取样，取样时防止外界杂菌混入。无菌试验期间应及时观察无菌试验样品，以便能及早发现染菌。注意事项种子培养期染菌的处理二、杂菌后处理方法种子罐染菌发酵罐×物料管道供气管道彻底灭菌备用种子无重新制备种子有发酵前期染菌的处理发酵前期染菌的处理培养基中碳、氮含量高终止发酵，重新灭菌再接入种子进行发酵培养基中碳、氮消耗量多放掉部分料液，补入必要营养，重新灭菌再接种发酵降温培养、调节ｐＨ、补加培养基发酵中后期染菌的处理发酵中后期染菌的处理轻微染菌适当加入杀菌剂或抗生素及正常的发酵液以抑制杂菌的生长速度。代谢产物已达一定水平明确是染菌可放罐或继续培养加热至1２0℃，保持30分钟后排放无提取价值的发酵液案例：柠檬酸发酵中期染菌，处理措施：处理措施应具体问题具体分析、多种方法综合应用，如污染细菌：加大通气量，加速产酸，必要时加入盐酸调节pH，抑制杂菌污染酵母：可加入0.025~0.