鸡艾美耳球虫套式pcr鉴别方法的建立

鸡艾美耳球虫套式pcr鉴别方法的建立

鸡球虫病是导致养鸡业损失的主要原因之一。其危害轻则导致鸡的生长发育受阻和生产性能下降,重则造成鸡的大批死亡,尤其是雏鸡阶段,15～50日龄的雏鸡发病率高,死亡率高达80%。鸡对抗球虫药物抗药性的不断增强,致使该病的危害日趋严重。目前,对Eimeria虫种的鉴定主要集中在形态学、生物学特性及由其导致的病变特征等方面,而对Eimeria的分子鉴定和同源性分析研究较少。由于不同种类的Eimeria多在同一地域交叉流行,这进一步说明了开展Eimeria分子鉴别检测的重要性。核糖体内部转录间隔区序列(ITS)存在于高度重复的核糖体中,它的进化速度快且序列较短,适用于分析科间、属间及种间的遗传关系。本研究对哈尔滨地区鸡Eimeria的ITS1序列进行鉴定,建立了套式PCR种间鉴别诊断方法,并将该序列用于同源性分析研究中,旨在为进一步研究Eimeria的分类和流行病学奠定基础。1材料和方法1.1pcr体系建立试验组6种鸡Eimeria:柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)HEB.Ten株、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)HEB.ace株、早熟艾美耳球虫(E.praecox)HEB.pra2株、和缓艾美耳球虫(E.mitis)HEB.mit株、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)HEB.nec1株和布氏艾美耳球虫(E.brunetti)HEB.bru株由本实验室分离,用于建立套式PCR体系;参考虫株中的E.necatrixHRB.nec2株由东北农业大学病理教研室提供,E.brunettiSH.bru株、E.praecoxSH.pra1和SH.pra2株、E.tenellaSH-ROUZHI株、SH-IKF株及SH-A121株DNA由中国农业科学院上海兽医研究所惠赠,并由本实验室保存于-80℃。1.2根生化科技有限公司DNA提取试剂盒和凝胶回收试剂盒:均购自天根生化科技有限公司;ExTaq酶、dNTPs、限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ、pMD18-T载体:均购自大连宝生物工程有限公司。1.3引物的设计与合成分别取试验组单卵囊增殖纯化后6株Eimeria和参考虫株中E.necatrix的1×106个孢子化卵囊,加入500μLPBS,于玻璃研磨器内充分研磨,12000r/min离心2min,取沉淀按DNA提取试剂盒操作说明提取基因组DNA,-20℃保存。参考GenBank中登录的Eimeria属下各虫种的ITS1序列,用PrimerPremier5.0软件设计1对通用引物扩增ITS1全长,同样设计针对不同Eimeria虫种的特异性套式引物(见表1),引物由上海英骏生物技术有限公司合成。试验组和参考虫株共13株Eimeria的套式PCR反应体系(50μL)包括:双蒸水32.5μL;10×PCR反应缓冲液5μL;MgCl2(25mmol/L)4μL;dNTP(各2.5mmol/L)4μL;10μmol/L上、下游引物各1μL;5U/μLExTaq酶0.5μL;模板(通用引物PCR以保存的DNA为模板,种特异性引物PCR以通用引物PCR产物为模板)2μL。所有PCR扩增条件为:95℃10min;94℃30s、退火温度(见表1)30s,72℃30s,25个循环;72℃10min。同时设不加DNA模板的阴性对照,PCR扩增产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳检测。1.4pcr扩增条件选择用试验组中6种Eimeria的通用引物扩增产物为模板,分别用单一的种特异性引物以同样条件对6株Eimeria进行PCR扩增,以鉴定引物的特异性。1.5pcr检测dna将试验组中6种Eimeria卵囊按相同比例混合后提取DNA,用通用引物扩增后,取扩增产物再分别以种特异性引物进行PCR扩增,以鉴定引物的特异性。1.6mdh5感受态细胞内表达突变体的构建按照胶回收试剂盒说明书纯化试验组和参考虫株共13株艾美耳球虫套式PCR扩增产物,按说明书操作连接于pMD18-T载体中,转化DH5α感受态细胞内。筛选阳性重组菌,抽提重组质粒,进行PCR鉴定和EcoRⅠ+HindⅢ双酶切鉴定,同时设不加模板的阴性对照。阳性重组菌由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。1.7序列分析将试验组和参考虫株13个测序虫株的ITS1序列经调整后导入DNAStar软件中进行序列比对分析。2结果2.1brunti的snpe序列和mcis的pcr扩增试验组中6种鸡艾美耳球虫通用引物PCR扩增结果(见图1A)为:E.tenella和E.necatrix的ITS1序列较大,约600bp;其次是E.brunetti的ITS1序列,约550bp;E.praecoxITS1序列约为450bp;E.acervulina约为400bp;E.mitis比E.acervulina稍小,约390bp。特异性引物套式PCR扩增结果(见图1B)为:E.tenella、E.acervulina、E.praecox、E.mitis、E.necatrix和E.brunetti扩增片段分别约为330、325、348、202、160和312bp。2.2引物扩增产物的pcr扩增效果利用种特异性引物分别对试验组6种Eimeria的通用引物扩增产物进行套式PCR特异性鉴定,结果显示(见图2)引物的特异性较好,除个别产生弥散条带外,其他扩增结果与预期片段大小相符,表明引物特异性良好。2.3套式pcr检测将试验组中6株Eimeria的卵囊按相同的比例混合并提取DNA后,分别进行套式PCR扩增。结果显示(见图3)5种Eimeria扩增出的目的片段与预期片段大小相同,仅E.necatrix的扩增(见泳道5)出现2条扩增带,且都不与预期片段大小相同。2.4不同种间的实行菌株his1测序结果将所有13个测序虫株的ITS1序列经调整后导入DNAStar序列分析软件中,结果显示同一虫种不同株的ITS1序列的一致性较高(见表2,其中右上部分为序列的一致性,左下部分为序列的差异性)。E.praecoxHEB.pra2株与E.praecoxSH.pra1株和SH.pra2株的一致性分别为98.6%和98.8%;E.necatrixHEB.nec1株与HRB.nec2株的一致性为97.0%;E.brunetteHEB.bru株与SH.bru株的一致性为97.0%;E.tenellaHEB.Ten株与E.tenellaSH-A121株、SH-IKF株和SH-ROUZHI株的一致性均为98.5%(见表2)。由此证明鸡球虫种内不同分离株间ITS1序列的一致性较高,仅有个别碱基的差异。而不同虫种间的ITS1序列一致性均在25%左右,最高为33.2%,最低仅为16.9%,种间的一致性较低。因此,ITS1序列可用于鸡球虫种间区分和鉴定,亦可用于鸡球虫种内不同分离株的区分和鉴定。3整株种间鉴别和系统发育分析鸡球虫虫种之间没有交叉免疫原性,同一宿主可感染数种球虫,而且不同地理区域球虫种类的分布和致病力差异亦有所不同。所以,了解一个地域鸡球虫种类及流行情况,对于球虫病的防治具有重要的指导意义,而对球虫种类的鉴定更将成为调查的关键。传统的球虫分类和鉴定主要依赖于生物学和形态学方法。然而,仅依靠形态学及生物学特征对鸡球虫进行种类鉴定往往不够准确,结合分子生物学方法对其遗传标记位点的研究能实现球虫的种间鉴别分类和系统进化分析。球虫核糖体DNA中介于18S和28S之间的ITS序列具有高度的保守性和进化的时钟性,被有效用于球虫种间鉴别诊断和系统进化研究中。本研究以ITS1序列为靶位点,设计Eimeria种间通用引物和特异性引物,针对在哈尔滨分离的6株Eimeria建立了套式PCR种间鉴别诊断方法。在混合卵囊PCR特异性检测试验中,E.necatrix的特异性引物出现非特异性扩增。这说明本试验设计的E.necatrix的特异性引物仅适