一测多评法测定三黄片中大黄类成分的含量

一测多评法测定三黄片中大黄类成分的含量

适应中药特点的新中医质量评价方法是目前中医研究领域的重点和难点。2005年,本课题组首先提出了“一测多评”(quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-marker,QAMS)的中药质量评价新模式,并以木通为研究对象,进行了一系列方法学研究,该模式借鉴了经典的内标法、校正因子法、主成分自身对照法和紫外百分吸收系数法的优势,选择中药中固有成分作为内参物,使用纯品建立内参物与其他待测成分之间的相对校正因子。实际应用时直接采用相对校正因子计算其他待测成分含量。目前虽然该方法已成功应用于木通、黄连、人参等20种常用中药的质量评价研究,其中黄连的质量评价方法还被2010年版《中国药典》收载,但是该方法在中成药中的应用还鲜有报道。为此,本研究以三黄片为研究对象,对QAMS技术在含大黄中成药质量评价中应用的技术可行性开展了研究。1高效液相色谱法测定药物WatersAlliance高效液相色谱仪,包括2695溶剂管理系统,2996二极管阵列检测器,Empower2色谱工作站(美国WATERS公司);ShimadzuLC20A高效液相色谱仪,包括LC-20AT溶液传输单元,SIL-20A自动进样器,SPD-M20A二极管阵列检测器,LCSolution色谱工作站(日本岛津公司)。色谱柱:DiamonsilC18(2)(4.6mm×250mm,5μm),SynergiHydro-RPC18(4.6mm×250mm,5μm),KromasilC18(4.6mm×250mm,5μm),XtimateTMC18(4.6mm×250mm,5μm),AccurasilC18(4.6mm×250mm,5μm)。大黄酸(批号110757-200206)、大黄素(批号100756-200211)、大黄酚(批号110796-201017)供含量测定用;大黄素甲醚(批号110758-200006),购自中国药品生物制品检定所,供鉴别用,经面积归一化法测定,纯度97.04%。甲醇为色谱纯,水为高纯水,其余试剂均为分析纯。22批三黄片为市售不同厂家、不同批号的商品。2方法和结果2.1方法和方法的研究2.1.1流动相中环境质量检测AccurasilC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相甲醇-0.4%磷酸水溶液(85∶15),流速1mL·min-1,柱温30℃,检测波长254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于4000。色谱图见图1。2.1.2氯甲烷-乙醇法取本品20片,除去包衣,精密称定,研细(过3号筛),精密称取0.26g,置锥形瓶中,精密加入95%乙醇25mL,密塞,称定,置水浴上加热回流1h,放冷,用乙醇补足失重,摇匀,滤过,精密量取续滤液10mL,置烧瓶中,减压蒸干,分别加入30%乙醇-盐酸(10∶1)的混合溶液和三氯甲烷各15mL,置水浴中加热回流1h,放冷,置分液漏斗中,用少量三氯甲烷洗涤容器,并入分液漏斗中,分取三氯甲烷层,酸液再用三氯甲烷提取3次,每次15mL,合并三氯甲烷液,减压回收溶剂至干,残渣加无水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液使溶解,转移至25mL量瓶中,并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。2.1.3混合对照品溶液精密称取大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品1.03,1.02,3.22,0.92mg,置25mL量瓶中,用少量氯仿溶解后加甲醇稀释至刻度,配成质量浓度分别为0.0412,0.0408,0.1288,0.0368g·L-1的混合对照品溶液1#,备用。分别精密吸取上述混和对照品溶液10,5,2.5,1.25,1,0.75,0.6,0.5mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液2#~9#,备用。2.1.4阴性对照溶液的制备按照三黄片处方工艺制备缺大黄的阴性样品,按2.1.2项下供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。2.1.5线性回归法分别精密吸取上述不同浓度的混合对照品溶液10μL注入高效液相色谱仪。以测得的响应信号(峰面积)和被测物的进样量(μg),用最小二乘法进行线性回归,得到各成分的回归方程以及线性范围。结果表明:大黄蒽醌对照品在如下范围内成良好的线性关系,见表1。2.1.6大黄素甲醚的稳定性取同一份三黄片供试品溶液连续进样6次,测定大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚4个蒽醌类成分的峰面积,计算RSD。结果各成分峰面积的RSD分别为0.20%,0.052%,0.15%,0.14%,表明仪器的精密度良好。2.1.7rsd测定取同一份三黄片供试品溶液,分别于样品制备后的0,1,2,3,6,9,12,15,18,24h进样,测定峰面积,计算RSD。结果三黄片中大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚4个蒽醌类成分峰面积的RSD分别为1.3%,1.2%,1.5%,1.6%,表明24h内,供试品溶液的稳定性良好。2.1.8加样回收率的测定取已知含量的三黄片粉末约0.13g,精密称定,平行6份,分别按样品含量-对照品(1∶1)的大致比例加入一定量的对照品溶液,按2.1.2项下方法制备供试品溶液,测定并计算各成分的加样回收率以及RSD。结果大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚4个蒽醌类成分的加样回收率分别为102%,101%,101%,97.9%,RSD分别为1.5%,1.3%,1.1%,1.3%,表明该方法的准确度良好。2.2相对校正因子的确定2.2.1测设取2.1.3项下不同浓度的对照品混合溶液,按确定的色谱条件分别进样10μL,测定各成分的峰面积。根据相对校正因子计算公式,分别计算各待评价成分大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚与内参物大黄素间的相对校正因子,结果见表2。2.2.2色谱柱对相对校正因子的影响相对校正因子的重复性考察:按2.1.3项下对照品溶液(1#)的制备方法,平行制备6份混合对照品溶液,分别进样不同体积,测定峰面积,大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚与内参物大黄素间的相对校正因子分别为1.15,1.47,1.05,RSD分别为2.0%,3.0%,3.7%,表明各成分与大黄素间相对校正因子的重复性良好。仪器对相对校正因子的影响:采用KromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,分别考察了2种不同的高效液相色谱系统对大黄蒽醌相对校正因子的影响,结果大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚与内参物大黄素间的相对校正因子重现性良好,RSD<5%,见表3。色谱柱对相对校正因子的影响:采用WatersAlliance和ShimadzuLC20A2种不同的高效液相色谱系统,分别考察了不同品牌的色谱柱对大黄蒽醌相对校正因子的影响,结果大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚与内参物大黄素间的相对校正因子重现性良好,RSD<5%,见表4。流速对相对校正因子的影响:采用ShimadzuLC20A高效液相色谱系统和AccurasilC18色谱柱,分别考察了不同流速(0.9,1.0,1.1mL·min-1)对大黄蒽醌相对校正因子的影响,结果大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚与内参物大黄素间的相对校正因子重现性良好,RSD<5%,见表5。柱温对相对校正因子的影响:采用ShimadzuLC20A高效液相色谱系统和AccurasilC18色谱柱,分别考察了不同柱温(30,35,40℃)对大黄蒽醌相对校正因子的影响,结果大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚与内参物大黄素间的相对校正因子重现性良好,RSD<5%,见表6。2.2.3中药-中药-内药复合校正因子的确定综合上述影响相对校正因子的因素,将各次试验获得的相对校正因子取平均值,最终确定大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚与内参物大黄素间的相对校正因子分别为1.13,1.46,1.01,RSD分别为1.4%,0.87%,2.5%。2.3色谱峰的确定实验中分别考察相对保留值和保留时间差在不同品牌仪器和不同品牌色谱柱中的重现性。结果保留时间差的波动较为明显,相对保留值的波动相对较小,因此采用相对保留值法进行大黄蒽醌类待测成分色谱峰的定位较为可行。根据实验结果最终确定的大黄蒽醌间的相对保留值见表7。2.4黄片类成分多指标质量评价的准确性首先采用外标法对三黄片中4种蒽醌类成分进行多成分同步含量测定,再用建立的QAMS法对其含量进行计算,并将2种方法所得结果进行比较,以验证QAMS法用于三黄片蒽醌类成分多指标质量评价的准确性。结果表明,2种方法测得的蒽醌类成分含量没有显著性差异,相对偏差<5%,提示建立的方法具有较好的可信度,见表8。2.5色谱峰的定位与测定另取三黄片样品10批(邯郸摩罗丹药业股份有限公司),首先按照建立的QAMS法进行待测蒽醌类成分色谱峰的定位,并对其含量进行实际测算,得到保留时间及含量的计算值;再以多成分同步测定方法(外标法)进行反证,进一步验证QAMS法的合理性。结果表明,相对保留值定位方法可行,两种方法测得的大黄蒽醌含量无显著性差异。表明建立的QAMS法在三黄片蒽醌类成分检测中的适宜性良好,见表9,10。3待测成分色谱峰的定位采用二极管阵列检测器,在190~800nm波长下对供试品溶液和对照品溶液中欲测成分进行了全波长扫描。结果4个大黄蒽醌类成分在254nm波长附近均有明显吸收峰,此波长条件下,各待测成分色谱峰分离度良好,因此选择254nm作为检测波长,与2010年版《中国药典》一部大黄项下方法保持一致。大黄素是大黄中的主要特征性成分,化学性质较稳定、在药材中含量适中,对照品来源有保证且廉价易得,故选作内参物,能更好地体现QAMS法简便、易操作、低成本特点。待测成分色谱峰的准确定位是“一测多评”法成功应用的关键,本研究考察了相对保留值和保留时间差在不同品牌仪器和不同品牌色谱柱中的重现性,最后确定了以相对保留值佐以紫外光谱作为待测成分色谱峰的定位依据。由实验结果可以看出,不同品牌的C18色谱柱填料对大黄蒽醌的选择性较强,相同色谱条件下,大黄蒽醌在不同色谱柱上的保留行为有较大差异,特别是大黄素甲醚的保留时间最大相差12min。因此为了保证QAMS法待测色谱峰的准确定位,可参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》规定,对试验所需色谱柱型号和规格进行规定。由数据中可以看出,大黄蒽醌在KromasilC18,AccurasilC18,DiamonsilC18(2)3种色谱柱上的保留行为较为接近(相对保留值分别为r大黄酸/大黄素=0.64,r大黄酚/大黄素=1.42,r大黄素甲醚/大黄素=1.94,RSD分别为1.3%,2.5%,2.7%)采用实验确定的相对保留值进行定位可获得满意结果。本研究首次将“一测多评”法用于含大黄中成药的多指标质量评价,通过大量实验数据建立了大黄中4种蒽醌类成分间的相对校正因子(f254nm大黄酸/大黄素=1.13,f254nm大黄酚/