抗体药物偶联物的研究进展

抗体药物偶联物的研究进展

美国食品药品监督管理局（af）发布的评估结果的预期日期，对于医疗设施和分析人员来说是一个重要的日子，这一天关系到一家公司的命运。一些专业网站甚至投票预测结果。2013年2月22日似乎是一个例外,这一天罗氏的抗体药物偶联物Kadcyla(adotrastuzumabemtansine,T-DM1)毫无悬念地获得美国FDA批准,用于治疗HER2阳性同时对曲妥珠单抗和紫杉醇有抗药性的晚期或转移性乳腺癌患者。作为一种新型抗癌药—抗体药物偶联物(ADC)的代表,Kadcyla或许不应该那么引人注目,因为早在2000年第一个抗体药物偶联物Mylotarg(gemtuzumabozogamicin)就已经被美国FDA批准上市,尽管后来由于疗效有限和毒副作用较高,辉瑞公司主动在2010年把Mylotarg撤市,西雅图遗传公司的Adcetris(brentuximabvedotin,曾用名:SGN-35或cAC10-vcMMAE)在2011年8月又通过FDA快速通道评审,代表ADC药物的真正成功。但是Mylotarg和Adcetris都是针对血液肿瘤,和固体肿瘤相比组织结构相对简单,是ADC药物研发的理想靶点。Kadcyla是美国FDA批准的治疗固体肿瘤的第一个抗体药物偶联物,也是个体化治疗的一大突破。根据2012年11月发表在新英格兰医学杂志上的EMILIA临床实验结果,Kadcyla治疗组的客观应答率为43.6%,显著高于卡培他滨/拉帕替尼对照组的30.8%(P<0.001)。除此之外,Kadcyla组的所有二级实验终点都优于对照组。而且,3~4级不良事件的发生率也由卡培他滨/拉帕替尼组的57%降至Kadcyla组的41%。相信在不久的将来,Kadcyla将成为HER2阳性乳腺癌的一线标准疗法。Kadcyla由美国ImmunoGen制药公司研制,和罗氏属下的基因泰克公司联合开发。Kadcyla采用ImmunoGen的TAP专利技术把高活性的有丝分裂抑制剂DM1(一种美登素衍生物)用一个稳定的硫醚键接头连接到罗氏公司的曲拓珠单抗上。因为曲妥珠单抗对HER2有较高的亲和力,Kadcyla能有效地靶向结合表达HER2的乳腺癌细胞,而后内化并释放细胞毒DM1,剿灭癌细胞。Kadcyla把抗乳腺癌药曲妥珠单抗和美登素衍生物DM1结合到一起,充分利用了前者靶向、选择性强,后者活性高,而又消除了前者疗效低和后者副作用大等缺点。尤其重要的是,目前的ADC技术还远没有完美,只有小于百分之一到达标靶细胞,而只有更少的效应分子起到抗肿瘤作用,为现代制药企业留下巨大的改良空间。笔者相信,ADC在不久的将来会有更大突破,在抗肿瘤领域甚至有望取代单克隆抗体生物药。因为最近在ADC领域已经有很多优秀综述,从不同方面介绍这个领域的研究进展[4,5,6,7,8,9,10,11,12]。本文主要从化学角度出发,在介绍ADC领域的最新进展之外,深度分析ADC领域技术上存在的问题,以及中国公司进入这个领域要面临的挑战和解决方案。1抗机构设计、活性分子的优化及评价指标的确定抗体药物偶联物的概念可以追溯到100年前,PaulEhrilich勾画的“魔术子弹”(MagicBullets)概念就类似于今天的免疫毒素偶联物(immunotoxins)。ADC真正意义上的概念诞生于1958年,但技术上却困难重重。第一个现代版的ADC直到1975年才被报道,直到上世纪八十年代,ADC的开发随着非免疫性,尤其是人源化单克隆抗体的开发才出现重大突破。鉴于单抗优越的选择性和多功能性,今天抗体已经渗透到医药研究的每一个方面,成为人类对付疾病的关键手段。第一代ADC药物主要使用鼠源的单抗,因为人类的免疫反应造成一部分药物难以到达标靶。其次,早期使用的包括阿霉素(doxorubicin)在内的效应分子的生物活性较低,限制了第一代抗体药物偶联物的疗效。除此之外,抗体的来源、接头连接的方式和数目也未得到优化。以Mylotarg为代表的二代ADC注重肿瘤细胞相关抗原的表达情况、靶向抗体的人源化程度、效应分子的活性、新型接头的稳定性以及裂解效率等ADC作用机制的关键节点。随着Kadcyla的成功,作者预计ADC全面发展的时代已经来临:无论是设计还是生产新型活性更高,分子量更小、渗透力更强的抗体或抗体片段的技术已经成熟,大量高活性的效应分子已经发现,越来越理想的接头也已经产生。当然,设计理想的ADC药物,在优化每一个组件的基础上,仅仅把各个优化的片段组装起来是不够的,ADC要作为一个整体,全面、综合地评价,进一步改良偶联物的稳定性、生物利用度、内化效率和效应分子的释放度等关键技术指标,以便达到预期的治疗目标。如图1所示,ADC由“抗体”、“接头”和“效应分子”三个主要组件构成。效应分子(payload)原指细胞毒素加上接头部分,现经常和细胞毒素混用。其中接头通常还包括和抗体偶联的隔离区(spacer)、化学或酶裂解区、释放效应分子的消除区等。今天ADC在抗肿瘤领域已经演变成为生物抗体药的主要类别之一。和传统的完全或部分人源化抗体或抗体片段相比,ADC因为能在肿瘤组织内释放高活性的细胞毒素从而理论上疗效更高。和融合蛋白相比,具有更高的耐受性或较低的副作用。经过几十年的改进,抗体药物偶联物的设计已经逐步完善,成为目前肿瘤研究的重要方向和研究热点之一。1.1其他化学成分化疗药物、毒素、放射性核素等对肿瘤细胞具有较大杀伤作用的细胞毒性物质理论上都可以作为抗体药物偶联物的效应分子。化疗药物原则上在足够高的浓度下都可以杀死癌细胞,但由于缺乏特异性,在杀伤肿瘤细胞的同时,也易损伤机体正常细胞,导致严重的毒副作用。ADC通过化学方法把细胞毒素和单克隆抗体偶联,偶联物在理想状况下对正常细胞,尤其在循环系统内不显示活性,只有在肿瘤组织内释放效应分子。这样ADC既有特异性识别肿瘤抗原的能力,也保留了效应分子杀伤肿瘤细胞的毒性,给药后定向浓聚到肿瘤组织,选择性地杀伤肿瘤细胞。图2列出ADC领域常用细胞毒素的化学结构。用于和单抗偶联的化疗药物的基本要求主要有三点:(1)作用机制清楚,如抗有丝分裂和DNA损伤剂等;(2)高活性,一般要求EC90小于1nmol·L-1;(3)可以采用化学方法偶联,并在肿瘤细胞内释放高活性的细胞毒素本身或其高活性衍生物。目前最常见的ADC效应分子包括两类微管蛋白抑制剂auristatins和美登素衍生物(maytansine)。Auristatins是全合成药物,化学结构相对容易改造,以便优化其物理性质和成药特征。用于和抗体偶联的auristatins衍生物主要包括auristatinE(MMAE,1)和auristatinF(MMAF,2),前者是由天然微管蛋白聚合酶抑制剂多拉司他汀(dolastatin)-10衍生的合成五肽,在C-端加上一个2-氨基-1-苯基丙烷-1-醇而成。MMAE对多种人类肿瘤细胞株的抑制活性小于一个纳摩尔。为了降低MMAE自身细胞毒活性,MMAF结构上在dolastatin-10的C-端加上一个苯丙氨酸,因为羧基的离子化,MMAF透析细胞膜的能力较差,因此对细胞的生物活性显著降低。但是和抗体偶联以后,MMAF对细胞的抑制活性能提高2000倍以上。合成的cAC10-Val-Cit-MMAF或者anti-CD70-ValCit-MMAF在动物实验中显示明显的疗效,尤其重要的是对部分耐药癌细胞也显示疗效。ADC药物的疗效风险比从而得到显著地提高。美登素(3)发现于20世纪70年代初期,是从非洲灌木(Maytenusovatus)树皮中分离得到的。通过与长春花位点结合,抑制微管蛋白聚集,从而导致肿瘤细胞凋亡。美登素衍生物可以通过从发酵制备的ansamitocins半合成而成。更重要的是修饰C3位得到含有N-酰基-N-甲基-L-丙氨酰侧链的美登素,这个侧链可以进一步修饰而且并不显著影响其活性。DM1(3b)和DM4(3c)都是美登素(maytansine)的衍生物、直接或间接地由双硫键(DMDS)或稳定硫醚键(SMCC)与抗体相连接。美登素衍生物DM1SMe和母体本身的细胞毒性相近,对很多细胞的IC50约为1×10-11mol·L-1,但DM4SMe的活性要高20~50倍左右,其IC50高达1×10-12mol·L。ADC常用的另外一类效应分子是作用于DNA的细胞毒素,包括calicheamicins(刺孢霉素,例如calicheamicinsγ,化合物4)、duocarmycins(例如duocarmycinA,化合物5和adozelesin,化合物6)以及pyrrolobenzodiazepines(PBDs,例如anthramycin,化合物7)等。刺孢霉素是天然的抗肿瘤抗生素,1987年最早自土壤微生物(Micromonosporaechinosporassp.Calichensis)中分离提取获得,是一族既有广谱抗菌活性又能强效杀伤多种肿瘤细胞的抗生素细胞毒素。刺孢霉素和DNA双螺旋结构的小沟结合,通过Bergman环化反应产生苯环双自由基,切割DNA双螺旋骨架并杀伤肿瘤细胞。刺孢霉素有7个主要衍生物,其中calicheamicinγ(4,CLMγ)活性最高,在临床上运用最多。刺孢霉素含有寡糖、刺孢酮和甲基三硫三个部分,其中甲基三硫充当引发装置,还原后启动Bergman重排反应并导致DNA裂解。包括duocarmycinA(5)、adozelesin(6)、CC-1065在内的duocarmycins家族来自抗肿瘤抗生素链霉菌。Duocarmycins能特异性地识别DNA小沟,并有效地烷基化DNA碱基N3位的腺嘌呤,具有很高的抗癌活性。遗憾的是这类衍生物同样具有较高的毒性。和其他DNA作用剂不同,duocarmycin是前药,在和DNA小沟结合以后,分子活化并打开高张力的环丙烷和腺嘌呤结合。采用这类化合物作为效应分子并使用聚乙二醇为接头的发明已经被报道。和duocarmycin一样,pyrrolobenzodiazopine(PBD)是另一类天然存在的抗肿瘤抗生素,同样和包括嘌呤-鸟嘌呤-嘌呤序列的DNA小沟结合,和腺嘌呤的N2位置形成共价键。连接两个PBD产生的细胞毒素的活性可以高达1×1010~1×1012mol·L-1。早期使用的细胞毒素包括doxorubincin(阿霉素,10)或其同系物11,以及psymberin(9,irciniastatinA)。因为这些药物活性不够高,开发新一代ADC化合物已经很少采用这些化合物作为效应分子。1.2br98—接头ADC的接头极为关键。简单地说,接头至少要符合两个标准:(1)在体内足够稳定,不会在血液循环中脱落,避免因效应分子脱落产生毒性;(2)在靶点有效地释放效应分子。实际上接头的设计会因ADC的不同而非常复杂,相同的接头在不同的ADC分子中会表现不同性能。除此之外,有些偶联物即使接头不在肿瘤细胞内释放药物也能产生疗效。一部分接头也会因偶联的方式或抗体不同而导致沉淀(聚合)反应等。本文首先简单介绍目前经常使用的接头,而后分类讨论在不同情况下接头的选择。总之,通过选择适当的接头和在适当位点偶联适当个数的效应分子,ADC在抵达靶点之前应该表现和裸单抗(nakedmAb)相同特征,其中包括和单抗本身同等的稳定性和半衰期以便减少给药频率,对抗原相同的亲和力以保持同等的靶向性,以及类似单抗或更高的细胞内化功能等。因为不同细胞表面表达有不同丰度的抗原,而且细胞内化常常是单抗药物表现活性的关键,同样也是ADC显示疗效的关键。经过近三十年的改造、进化,抗体和效应分子的连接技术已经趋于完善。接头从性能上可以分为两大类:可裂解性接头和稳定性接头。可裂解性接头又包括化学裂解性接头和酶催化接头两种。表1列出常用的几类可裂解性接头的化学结构、特征以及设计要点。1.2.1化学裂解型接头腙键接头——可裂解性接头是根据正常细胞和肿瘤细胞之间的区别来设计,以便体现对肿瘤细胞的靶向性。依据肿瘤细胞内呈弱酸性,比如溶酶体(lysosome)pH4.5~5.0及核内体(endosome)pH5.0~6.5,而循环系统呈中性pH7.3~7.5的特点,早期化学可裂解性接头采用酸性不稳定而在中性条件下较稳定的腙键(hydrazone)接头。体外实验表明,部分腙键接头在循环系统中24h大约有5%~6%的细胞毒素脱落,而在癌细胞内会高达97%~98%。BR96—MHH-阿霉素抗体药物偶联物就是采用在酸性环境中能被分解的腙键接头,MHH(表1)把人源化单克隆抗体BR96通过抗体表面的半胱氨酸(cysteine)和阿霉素连接而成。然而,腙键接头选择性相对较低,在循环系统中能释放一定的细胞毒素从而半衰期较短(43h),而很多裸抗体(nakedantibody)本身在人体内的半衰期可达至少几天甚至几周。尽管该施贵宝ADC在动物模型中高剂量下(100mg·kg-1体重)对肿瘤产生非常好的抑制效果,但临床实验却没有显示明显疗效。因为阿霉素对人体细胞株的活性相对较低,EC50只有0.1~0.2µmol·L-1。双硫键接头——依据双硫键能在细胞内还原的环境中被分解,而在循环系统中保持稳定的特征,双硫键接头是目前抗体药物偶联物领域常用的化学可裂解接头之一。但是,循环系统还原剂的浓度也相当高,比如谷胱甘肽(glutathione)的浓度高达微摩尔/升数量级。为了避免在血液中裂解,提高ADC的稳定性,常见的双硫键接头的一端通常引入一个(MDS,表1)或两个甲基(DMDS、DSDM,表1)修饰。在细胞内,尤其是相对缺氧环境的肿瘤细胞内谷胱甘肽的浓度要高一千倍(毫摩尔数量级),以致ADC化合物在肿瘤细胞内顺利裂解,释放细胞毒素。纽约州立大学的Ojima教授及其他研究人员采用单甲基修饰的双硫键接头(MDS)把靶向表皮生长因子受体(EGFR)的单抗KS77和紫杉醇衍生物10-MDSPrTaxoid(8,图2)偶联,得到的偶联物KS77-MDS-Taxoid在体外实验中对多种肿瘤细胞株显示EGFR诱导的抑制作用。小鼠接种实验表明,KS77-MDS-Taxoid能有效地抑制肿瘤生长,而紫杉醇本身没有显示任何疗效。利用相同的MDS接头,ImmunoGen研究人员把美登素衍生物TM1(3b)和人源化单抗huC242连接,得到的huC242-MDS-TM1(cantuzumabmertansine)每分子抗体含有4~5个药物。实验表明,cantuzumabmertansine在小鼠体内的半衰期为42.2h,和以上紫杉醇偶联物的结果相仿,都明显低于抗体本身的半衰期。针对相同的抗体和效应分子,采用二甲基修饰的接头DSDM偶联的ADC显示更长的半衰期。双功能接头——腙键或双硫键接头不仅可以单独使用,联合应用有时能提高释放细胞毒素的效率,表现更好疗效。美国FDA早在2000年通过快速通道批准上市的Mylotarg(gemtuzumabozogamincin)就是采用双硫键和腙键联用的NDMDS接头(表1),来连接人源化单克隆抗体CD33IgG4k和刺孢霉素(calicheamicin)而成(化合物12,图3)。4-(4-乙酰苯氧基)丁酸能选择性地和抗体表面的赖氨酸偶联,而后乙酰基和N-乙酰-γ-刺孢霉素二甲基酰肼缩合生成gemtuzumabozogamincin。借助抗体-抗原的相互作用,Mylotarg靶向性地内化到CD33阳性的血癌细胞,因为癌细胞内部pH值明显低于循环系统,加速了ADC腙键的裂解速度。Mylotarg临床上用于治疗急性髓细胞样白血病(ALL)的剂量为9mg·m-2,每两周给药两次,完全缓和率约30%。尽管多数临床前研究表明,采用双功能接头(NDMDS)制备的ADC通常显示更好的疗效,体外、体内实验却显示采用双硫键接头(DMDS)把鼠源单抗CTM01和刺孢霉素偶联的ADC(化合物13,图3)和采用NDMDS接头制备的偶联物相比活性相仿。1.2.2氨基苄基氨基甲酸酯衍生物二肽接头——循环系统和肿瘤的组织环境差异不够大,通常化学裂解型接头在血液中的稳定还不够充分,会因为细胞毒素脱落而导致系统不良反应。依据组织蛋白酶(cathepsin)、血浆酶(plasmin)等蛋白酶(protease)在肿瘤组织中高度表达,而这些酶在正常组织外因pH值较高而失去活性的事实,以及一些肽键能被溶酶体中的蛋白酶分解的特征,西雅图遗传(SeattleGenetics)公司率先采用含有一个缬氨酸-瓜氨酸的二肽接头(MHVCBC,表1)把微管抑制剂auristatinE或F偶联到人源化单克隆抗体。含有缬氨酸-瓜氨酸(vc)的二肽接头是目前应用最广泛的接头之一。利用还原单抗的双硫键产生多个游离巯基,比如还原抗CD30的单抗cAC10能得到8个游离巯基,而这些巯基可以与马来酰胺基团作用,生成cAC10-vcMMAE(14),也就是SGN-35或Adcetris。因为抗体上只有那些接近溶剂的巯基可以发生偶联反应,形成相对均一的ADC衍生物。如图4所示,该类ADC在抗原诱导内化后,肿瘤细胞内高度表达的组织蛋白酶、血浆酶切断二肽(vc)和苯胺之间的两个酰胺键,导致对氨基苄基氨基甲酸酯(18)的自身消除,释放细胞毒素MMAE。与化学裂解性接头相比,酶催化接头对循环系统有更高的稳定性。有数据表明,二肽接头比化学裂解性接头在人类循环系统的稳定性要高一百倍,在小鼠和猴体内的半衰期大约6~10天。和其他筛选的二肽相比,缬氨酸-瓜氨酸显示更高的血浆稳定性并在如组织蛋白酶(cathepsinB)催化下更容易裂解,是目前最理想的已知二肽接头。mAb-vcMMAE偶联物的疗效风险比(therapeuticwindow)高达200以上,也就是说在耐受剂量的二百分之一的剂量下,采用mAb-vcMMAE治疗,可以得到治愈或完全缓解。西雅图遗传生物制药公司的这一专利技术已经得到广泛应用。值得注意的是,二肽接头中的缬氨酸-瓜氨酸酶裂解区不仅可以放在隔离区和释放区的中间(比如MHVCBC接头,表1),也可以象MPVCBC接头(表1)一样,连到释放区的对位氨基上。只是这样连接方式的效果尚未见具体报道。β-葡糖醛酸接头——西雅图遗传生物制药公司根据肿瘤细胞葡糖醛酸酶的浓度要远远高于循环系统率先开发了β-葡糖醛酸接头(GBC)。如图5所示,葡糖醛酸接头的作用原理和二肽接头相似,偶联物21中的葡糖醛酸官能团在肿瘤细胞内被葡糖醛酸酶水解,释放的对-羟基表现一定负电性,并沿着苯环推动电子转移(22),释放细胞毒素。β-葡糖醛酸接头亲水性强,通常不会因为水溶性差而聚合,而且在循环系统体现较高的稳定性,个别含有葡糖醛酸接头的ADC半衰期长达81天。如果把传统β-葡糖醛酸接头在氨基甲酸酯和细胞毒素之间加上一个二甲基乙二胺隔离棒(24),β-葡糖醛酸接头就可以适用于含有任何羟基的细胞毒素。β-葡糖醛酸接头已经被广泛使用。Duocarmycin前药接头——如图6所示,SyntargaADC接头技术含有二肽切断区、自身消除区和前药释放区三个分子组成部分,最大的特色是效应分子duocarmycin以氯代物前药形式存在(27,图6)。在肿瘤细胞内组织蛋白酶切断偶联物27中二肽的酰胺键,启动对氨基苄基氨基甲酸酯的自身消除并形成中间体29。29中的氨基继而亲核进攻羰基并环化,释放duocarmycin前药30,并重排产生DNA切割剂duocarmycin。Syntarga技术有如下几个特点:和接头偶联以后效应分子则失去活性,以便降低对循环系统的毒性。该技术适用于所有含有羟基的效应分子。Synthon制药公司在2011年收购Syntarga以后,进一步扩展了Syntarga接头技术,把二肽酶解区连接到duocarmycin吲哚环6位的氨基上,和DNA双螺旋结构结合的吲哚环采用水溶性官能团保护。虽然不少技术细节未被公开,但是Synthon公司透露他们的偶联物在人类乳腺癌和非小细胞肺癌动物模型中显示惊人的药效,给药后导致动物肿瘤完全消失。不仅如此,这类化合物和其他ADC相比耐受性更好,疗效风险比有望居同类之最。当然,目前报道的仅仅是动物结果,这个药效是否能转化到人体还有待进一步考证。1.2.3生物活性分子的活性ImmunoGen发现硫醚键接头MHN和SAHN(表1)纯属偶然,如图3所示,最初他们制备由硫醚键连接的T-DM1抗体偶联物15只是用作对照品,结果显示这个ADC在循环系统内的半衰期显著提高。这些含有巯基的美登素衍生物能和微管蛋白结合,有效地抑制微管解聚,显示抗有丝分裂活性。不仅如此,对照品偶联物15显示很强的生物活性。被肿瘤细胞吞噬后,ADC的抗体部分在溶酶体内被破坏,释放了仍然带有赖氨酸但具有同等活性的美登素细胞毒素。估计因为可离子化的赖氨酸的存在,美登素衍生物不能通过细胞膜,因而无法渗透到相邻细胞并显示细胞毒性。所以这类ADC对不同细胞株的广谱性还有待确认。有数据表明,以T-DM1为代表的含有稳定性接头的ADC药物显示更高的稳定性和耐受性。和ImmunoGen相仿,西雅图遗传生物制药公司也采用类似的稳定硫醚键接头,把MMAF和抗CD30单抗或抗LeY单抗偶联,生成的偶联物保持原有的生物活性。降解后效应分子的质谱研究显示降解的MMAF含有一个半胱氨酸,尽管MMAE的结构相仿,但采用同样方式连接的ADC不显示明显疗效。PeterSenter等报道ADC化合物mAb-MHN-MMAF的效应分子可能和白蛋白交换,而这种交换可以通过乙酰胺取代马来酰胺抑制(表1),偶联物mAb-SAHN-MMAF非常稳定,在循环体系内14天没有观察到明显的降解。与二肽酶催化接头相比,适应于稳定接头的效应分子有很大随机性,到目前为止还没有一个明显规律可循。DM4和人源化单抗huC242偶联,形成的偶联物在体外显示良好的抗肿瘤活性,但是动物实验没有观察到显著的抗肿瘤效果。和以上相同,降解后效应分子也是Lysine-DM4。1.2.4以化合物类型为原料的adc化合物药物还可以直接通过共价键连接到单克隆抗体或抗体片段,并显示类似活性。这类ADC化合物的设计原理和采用稳定硫醚键接头的偶联物相仿,ADC内化并分解后,释放具有高活性的含有氨基酸残基片段的效应分子。其中连接药物和抗体之间的隔离区越短越有益于偶联物的稳定性和药效。1.3抗自身蛋白药物的作用抗体是抗体药物偶联物的制导部分。原则上说任何在肿瘤细胞表面表达的抗原,包括多肽、维生素、核酸适体等都可以成为ADC的靶标。虽然很罕见,理想抗体是针对那些仅仅生长在肿瘤细胞表面,而在健康组织或细胞表面不表达的抗原。除此之外,抗体药物偶联物不仅能在肿瘤细胞内释放效应分子,也必须能保持抗体或抗体片段原有的特征,比如保持IgG1抗体Fc链引入的免疫效应、抗体引起的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、吞噬或Fc介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)等。ADC的抗体部分至少具有三方面作用:(1)和裸抗体一样,能有效地把偶联物输送到靶向细胞表面,是“生物导弹”的制导系统;(2)诱导单克隆抗体的细胞吞噬(internalization),进入前溶酶体并导致效应分子细胞内的有效释放。对于靶向造血分化抗原的抗体,内化过程有时需要补体的参与;(3)保持裸抗体的全部或部分性质,诱导抗体依赖性的细胞毒性(ADCC),也就是说单抗部分也是有效的药物。目前常用的抗肿瘤单抗药物理论上都可以和药物偶联,制备抗体药物偶联物,靶向特异抗原高表达的肿瘤。根据不同靶点,常见单抗药物大致可分为以下几类:(1)以白细胞分化抗原CD分子为靶点的单抗,如抗CD20、CD33、CD52等单抗,多用于治疗白血病和淋巴瘤;(2)以血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)为靶点的单抗,如贝伐单抗(bevacizumab)等,多用于治疗结肠癌和胃癌;(3)以表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)家族为靶点的单抗,如抗EGFR单抗、抗表皮生长因子受体2(epidermalgrowthfactorreceptor2,HER2)单抗,多用于治疗实体肿瘤。近年来,抗HER2的治疗性单抗备受关注。HER2是EGFR成员,参与乳腺癌的发生,且与乳腺癌患者的预后有关。相应单抗与HER2结合可阻止HER2与相应的生长因子结合,抑制乳腺肿瘤细胞的分裂和转移,加速肿瘤细胞的清除。本实验室近期发现,抗HER2单抗还可以刺激机体的适应性免疫(adaptiveimmunity),阻止肿瘤转移并提高治疗效果。依据抗原分类,林莉等最近已经对不同抗体制备的偶联物做过详细的描述。抗体的选择对ADC的成功起着关键性的作用。肿瘤细胞表面抗原表达的数量、细胞吞噬抗体的速率、以及靶标从细胞膜上脱落等因素都会影响到ADC的活性。CD19、CD20、CD22、CD30、以及HER2均为常见的标靶。理想的抗体是那些单克隆抗体或抗体片段能高效率地识别、结合绝大部分肿瘤表面的抗原或受体,并且在细胞表面上有效地被肿瘤细胞吞噬,进入前溶酶体并破坏肿瘤细胞。这样,除了抗体本身的抗癌作用以外,释放的细胞毒素进一步扩大对肿瘤细胞的杀伤范围。2抗药物偶联物的分子特征很多数据显示,临床上成功的ADC具有几乎所有抗体药本身的优点,同时又避免了裸抗体的缺陷,尤其重要的是因为能释放高活性的效应分子,ADC疗效明显优于抗体本身。随着Kadcyla和Adcetris的上市,ADC尤其在抗肿瘤领域将来有望成为生物抗体药的主流。经过几十年的探索,ADC在技术上也日趋成熟。ADC既可以看作是一种理想的前药设计理念,也可以是精确靶向肿瘤的药物输送系统。设计成功的抗体药物偶联物不仅要优化每一个组件,也要注重每个组件的配搭和相互影响。如图7所示,ADC药物要达到设计目标至少要突破四项主要屏障。对固体肿瘤而言,ADC首先需要渗透到肿瘤组织才能和靶向抗原结合,而抗体的分子大小、对抗原的亲和力等性能是决定偶联物的渗透性和对靶向细胞粘合性的主要因素。其次,只有被靶向细胞吞噬的偶联物才能进入酶溶体,已有数据表明只有小部分ADC才能被肿瘤细胞吞噬并产生作用。抗体药物偶联物的下一个屏障是酶溶体内的裂解,尤其对于那些以稳定性接头相连的ADC,只有被酶溶体裂解的偶联物才能释放效应分子并产生抗体依赖性细胞毒性。当然,有效地释放效应分子并诱导细胞凋亡是抗体药物偶联物的最终目标。除此之外,设计理想的ADC药物还要明确突破以上屏障的关键作用节点和理想的分子特征,而后优化每一个可能影响的因素。理想ADC应该有下列分子特征:(1)稳定性。ADC通常采用静脉注射给药,既要方便患者减少给药频率,又要保持一定的血药浓度,理想的ADC药物必须在循环系统有足够的稳定性。而稳定性又和抗体的天然特征如鼠源还是人源化的,分子大小、偶联物接头的稳定性、效应分子性质和个数等相关。(2)渗透性。由于肿瘤尤其是固体肿瘤组织的复杂性,良好的渗透性是生物抗体药有效抵达靶点组织的必备条件。通常渗透性和药物的分子量成反比。(3)抗体对抗原适当的亲和力。肿瘤细胞表达抗原的丰度和抗体对抗原的亲和力直接影响抗体药物偶联物的粘合效率,其中药物动力学又起到关键性作用。(4)吞噬率(rateofinternalization)。包括抗体和抗原的天然性能等很多因素影响肿瘤细胞对抗体药物偶联物的吞噬率。(5)效应分子的释放。药物在肿瘤细胞内从偶联物上的脱离效果(通常通过溶酶体起作用)对ADC的疗效起关键性作用。(6)效应分子的扩散。鉴于细胞表面抗原表达丰度的不同导致细胞吞噬的不均一性,在很多情况下效应分子必须迁移到周围细胞才能杀伤这些癌细胞。再者,效应分子在细胞内也需要迁移到靶向区域比如细胞核(DNA)或微管等才能发生作用。下面分别从抗体、弹头和接头三个方面分别探讨优化改良每个关键接点的策略和技巧。2.1以单克隆抗体或抗体片段为制导系统的adc药物很多ADC理想的成药性能和抗体自身的天然特征相关,而且也可以通过修饰抗体改善。前面指出,任何靶向生长在肿瘤细胞表面的多肽、维生素以及核酸适体等抗原的分子体系原则上都可以作为ADC药物的制导系统。因篇幅限制,本文主要讨论以单克隆抗体或抗体片段为制导系统的ADC药物。下面是选择和优化抗体需要慎重考虑的一些因素。2.1.1免疫原his抗原、抗体和偶联物的性质都会影响内化的速率和效率,从而影响偶联物的细胞吞噬和安全性,其中抗原的分布和丰度是选择靶点的关键。无论是肿瘤还是其他适应证的靶点,理想情况下,ADC靶向的抗原应当分布于靶标细胞的表面,而正常细胞不表达同样的抗原。当然这样的理想状况并不存在,一般认为虽然癌细胞不大生长全新抗原,因为一旦形成就被机体的免疫系统清除,但癌细胞表面表达的抗原数目和正常细胞有明显区别。所以,正常组织或多或少地表达一定丰度的相同抗原,而肿瘤细胞和正常细胞表达该抗原的比值,以及抗原在肿瘤细胞表面表达的均一性直接影响抗体药物偶联物的选择性。除此之外,对于不同的ADC,其标靶抗原表达的数目差异较大。比如CD33阳性的急性髓性白血病细胞(AML)的抗原表达相对较低,每个细胞表达约5千至1万个受体。靶向CD33的Mylotarg在临床前以及临床实验中表现明显的疗效。相反,部分HER2阳性的转移性乳腺癌患者中,每个细胞有时表达超过3百万个抗原。以HER2为靶标的Kadcyla也表现明显的疗效。所以,肿瘤细胞表面抗原的表达数目和ADC的疗效有一定相关性,但只要设计合理,靶向低表达抗原的ADC同样能产生显著疗效。因此在立项之前,研究人员必须对靶点尤其是靶向该靶点的抗体有较多的了解,挑选那些已经做过大量研究的单抗制备偶联物,相反,则可考虑采用上市或临床证实过疗效的单抗为起点。2.1.2人类免疫药物主要利用1975年英国科学家Milstein和其博士后Kohler共同发明的杂交瘤单克隆抗体技术,早期开发的单抗药物大部分是鼠源的。然而,人类免疫系统能够清除外来物质,在很大程度上限制了鼠源抗体的疗效。在以后的一段时间里,尤其在抗肿瘤领域,降低抗体的自身免疫性成为生物抗体研究领域的重点之一。嵌合型、改型或表面重塑、以及抗体库技术也应运而生。因为人源化改造过程复杂、工作量大,而且鼠源成分较难消除彻底,目前制备全人源单抗或抗体片段通常采用抗体库筛选技术、基因工程小鼠以及包括大肠杆菌、酵母、昆虫杆状病毒、哺乳动物细胞等人源单克隆抗体表达系统。2.1.3抗原螯虾的分子通常认为,只有远低于百分之一静脉注射的效应分子真正能抵达肿瘤细胞并起作用。其中抗体分子的大小起着举足轻重的作用。血管壁、组织屏障、血脑屏障的穿透性直接和抗体分子的大小相关,在其他条件相等的情况下,分子量越小穿透力越强,但也越容易被肾脏清除,导致半衰期降低。所以,在构建治疗性重组抗体时要同时兼顾表达产物的分子量大小,以便改善抗体的穿透性及代谢动力学、半衰期长短和清除率等。如果抗体分子很大,超过肾清除体积,或者较小但具有相当高的亲和力,则能延长半衰期并提高吸收率。在保持抗原性和亲和力不受影响的前提下,改善相应的抗体大小、抗体结合价的数目和融合蛋白的形式,可以保证目标ADC有足够长的半衰期和血药浓度。2.1.4人源化抗体的培养抗体对抗原的亲和力是发挥抗体效应功能的首要条件,也是重组单抗人源化改造的主要瓶颈之一。一般来说,人源化抗体只能达到最初鼠源抗体亲和力的1/2~1/3。所以保持或提高原始抗体的亲和力是构建人源抗体的重要目标之一。很多实验证明,抗体亲和力的改良也需要一个平衡,太高了虽然有利于和抗原结合,但也更易被机体清除,通常保持偶合常数在1×10-7~1×10-9mol·L-1为最佳。2.1.6偶联效应分子的优化除了极少部分抗体可以利用抗原结合位置和药物结合以外,重组DNA技术也可以引入需要的氨基酸,所以偶联通常不是设计抗体药物偶联物的一个主要障碍。为了保持裸抗体包括半衰期、亲和力等原有的特征,尤其保证引入细胞毒素的固定个数和偶联物的均一性,偶联氨基酸残基(接点)的位置和性质非常关键。最常见的偶联方式是通过赖氨酸(lysine)或半胱氨酸(cysteine)偶联。其他适用于偶联的官能团还包括谷氨酸(glutamine)、糖基、或SNAP-tag。多数抗体富含活泼的赖氨酸,比如trastuzumab含有88个赖氨酸,所以赖氨酸是最常见的偶联接点之一。但必须注意,采用表面赖氨酸为接点,有可能改变抗体携带的正电荷,甚至显著降低其稳定性。所以以赖氨酸为接点的ADC化合物对偶联药物的个数更敏感。第一代抗CD30-vc-MMAE是通过还原抗体的双硫键形成8个巯基而后偶联而成。因为单抗只有4个双巯键能被还原,所以最多只能形成8个半胱氨酸巯基。这样得到的ADC具有较高的均一性,每分子抗体可以引入8个效应分子。但是实验证明,这样形成的ADC和抗体本身相比,在循环系统内清除率要快很多。尽管Adcetris每个抗体分子只含有4个MMAE,体外活性也比抗CD30-vc-MMAE低一半,动物实验显示出相似的疗效。这两个化合物头对头比较显示,前者含有8个细胞毒素的ADC血液清除率比后者快一半,更重要的是耐药性和细胞毒素个数直接相关,成正比,也就是说尽管这两个ADC化合物展现类似的药效,但是含有4个效应分子的后者耐药性能好一倍,即疗效风险比高一倍。所以优化偶联效应分子的个数非常重要。通过蛋白重组(recombinant)技术制备含有固定氨基酸残基的单抗用于偶联是一个更理想的办法。第一个按照这个思路开发的cAC10把相关半胱氨酸(cysteine)采用基因工程用丝氨酸(serine)取代。采用这个方法制备的ADC,每分子抗体含有2~4个药物,偶联均一性明显优于其他偶联的模式。头对头临床前实验比较发现,亲和力、细胞毒性、体内耐药性、以及药效仅仅和偶联药物的个数相关,无论是Adcetris还是重组蛋白取代丝氨酸的化合物,含有4个MMAE的ADC显示同等的药效和耐受性。其他常见的偶联途径是在固定位点构筑半胱氨酸。如在抗-muc16单抗thiomab固定区域构筑两个分子的半胱氨酸,通过和含有Val-Cit-MMAE的马来酰胺缩合,得到含有每分子1.6个MMAE的偶联物TDC。尤其重要的是这样制备的TDC和传统方法制备的含有3.1个细胞毒素的ADC在小鼠接种动物实验中显示相同的药效,但是耐受性有显著提高。所有数据都表明每抗体分子含有2~4个效应分子是最佳比例。除了在大部分情况下有碍单抗的半衰期以外,携带更多细胞毒素的另一个副作用是过多的细胞毒素可能使抗体整体的变化较大,导致人体免疫系统认为抗体有损伤或破坏,以致启动清除机制,排出体外。不同接点或偶联方式明显地影响偶联物的均一性。以Mylotarg为例,通过修饰表面的赖氨酸进行偶联得到的平均药物抗体比(DAR)约2~3,但大约50%的抗体连有4~6个细胞毒素,而另一半抗体根本就是裸着的。T-DM1平均DAR是3.5个,但范围是1~7个。Adcetris的DAR是4,其分布是每分子抗体含有0~8个药物分子。Hutchins等最近还报道在IgGFc抗体的C端嵌入一个非天然氨基酸selenocysteine(Sec),并用于和效应分子偶联。2.1.7偶联条件traut在设计ADC化合物,尤其是挑选合适的接头和抗体的时候同时必须考虑适用的偶联反应。除此之外,还要考虑到抗体在偶联条件下的稳定性。如果为了更有效地控制偶联位点,用游离巯基为接点,常见的偶联条件包括Traut试剂(2-iminothiolane)、SATA(N-succinimidylS-acetylthioacetate)、SAMSA(S-acetylmercaptosuccinicanhydride)。抗体表面的巯基既可以采用DTT(dithiothreitol)、AET(2-aminoethylisothiouroniumbromide)或TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)还原双硫键获得,也可以通过基因改造,直接在抗体表面引入游离的半胱氨酸、或硒代半胱氨酸残基(Sec)。2.2在临床试验中的应用如果说抗体的重要性相当于是导弹的制导部分,那么细胞毒素的作用就相当于弹头。第一代ADC失败的主要原因之一就是细胞毒素活性不够。比如施贵宝研究人员早期采用腙键接头(MHH)把阿霉素(doxorubincin)连到人源化单抗BR96上。因为阿霉素活性较低,形成的BR96-MHH-doxorubincin需要高达100mg·kg-1体重的剂量才可以完全清除小鼠或大鼠肿瘤。一期临床试验最大耐受剂量高达700mg·m-2。另外,实验还发现该ADC药物的半衰期在人体内仅为43h,而且对肿瘤没有明显的抑制作用。其中阿霉素的低活性、接头的不稳定性、以及非肿瘤细胞也表达相当数量的抗原是这次失败的主要原因。除此之外,BR96-MHH-doxorubicin中每个抗体含有8个阿霉素分子,药物/抗体比值偏高,可能是导致半衰期显著降低的另一个重要因素。早期的经验教训使研究人员认识到细胞毒素活性的重要性,随后一系列包括刺孢霉素(calicheamicin)等高活性药物被连接到抗体上。和阿霉素抗体偶联物相比,连接刺孢霉素ADC的活性远远高于前者,给药剂量显著降低。头对头比较发现,采用刺孢霉素为效应分子的ADC在2mg·kg-1体重的剂量时可以达到阿霉素100mg·kg-1体重的剂量疗效。这个结果和体外实验一致,如刺孢霉素衍生物ADC对多种细胞的活性比阿霉素同系物要高1000倍以上。事实上,第一个上市的ADC药物Mylotarg(12)就是采用刺孢霉素为弹头的。临床上在9mg·m-2的剂量下,大约有30%的AML患者得到完全缓解。但该产品因较大副作用且不能有效延长患者的总存活期在2010年撤出市场。很有可能因为双硫键-腙键双功能接头的血液稳定性不是足够好,比如其半衰期仅有72h。这也是很多不表达CD33的AML患者也显示疗效的原因。尽管如此,Wyeth(现辉瑞公司)的一个类似ADC化合物inotazumabozogamicin(CMC-544)使用和Mylotarg相同的双硫键-腙键双功能接头,把一个人源化抗CD22单抗和刺孢霉素连接,这个ADC的稳定性或半衰期远远高于Mylotarg,4天的裂解率只有1%~2%,说明ADC的稳定性不仅和使用的接头有关,也和连接的单抗结构相关。然而,辉瑞刚刚披露inotazumabozogamicin在一个三期临床试验中和对照组相比没有显著提高患者的总生存率(OS)。这个代号为B1931008的随机、开放标签、双组的临床试验评价inotuzumabozogamicin对不适合高剂量化疗、复发性或难治性非霍奇金淋巴瘤患者的安全性及疗效。在这项研究中,治疗组采用inotuzumabozogamicin和美罗华联合用药,每月给药一次,对照组采用苯达莫司汀(bendamustine)或吉西他滨/美罗华组合。中期数据统计指出,inotuzumabozogamicin联合用药组和对照组相比没有提高总生存率(OS),辉瑞因此终止了该临床试验。Inotuzumabozogamicin的这个三期临床试验失败说明,ADC药物的开发可能远不止技术上的突破,还有更多前所未知的分子机制有待探讨。不过,inotuzumabozogamicin的其他两个二期临床试验还在进行,治疗非霍奇金淋巴瘤,一个三期临床试验因为注册患者人数太少而流产。效应分子的选择非常广,原则上只要对肿瘤细胞的抑制活性足够高,比如说IC50小于0.1nmol·L-1的化合物都可以用作偶联药物。近年来很多公司甚至采用靶向药物作为ADC的弹头,并且取得可喜结果。为了取得细胞毒素的最大活性,通常在设计ADC化合物时尽量做到在肿瘤内释放细胞毒素本身,当然在很多情况下化学修饰过的弹头表现同等或甚至更高的活性。除了刺孢霉素以外,最常用的细胞毒素还有auristatin、美登素(maytansine)、duocarmycin衍生物等。鉴于活性高、化学修饰简单、以及广谱性,作者更推荐美登素和auristatin衍生物作为理想的弹头,更重要的是前者没有专利保护,而后者在2017年专利即将到期,考虑到ADC的开发时间,因此也不会有知识产权纠纷。Auristatin类细胞毒素中的MMAF因为含有一个羧基,在循环系统内带有负电荷难以渗透细胞膜,因此MMAF本身的活性较低,而和一些抗体偶联以后显示和MMAE类似的活性,是ADC理想的弹头。当然,采用自主知识产权,活性更高,而又符合以上偶联条件的细胞毒素或靶向药物是更好的选择。2.3稳定接头偶联物接头的分子结构不仅对ADC的稳定性起关键作用,还可以直接影响偶联物的生物活性、聚合状态(沉淀反应)、生物利用度和体内分布。理想的接头除了要满足前面谈到的循环系统稳定性和在肿瘤细胞内有效地释放效应分子这两个基本要求以外,在选择或设计接头时尤其还要注意以下几点:(1)水溶性。接头对水溶性的要求根据效应分子的不同而变化。如果效应分子的水溶性较差,则尽可能选用水溶性较大的接头,以避免ADC的聚合或沉淀。除了设计或挑选象葡萄糖醛酸接头(GBC)等水溶性高的接头以外,还可以在裂解区两边增加水溶性(比如聚乙二醇)的隔离棒(spacer)来提高接头的水溶性。另外,偶联反应通常也是在水溶液中进行。(2)接头类型。接头的分子结构因靶标、抗体以及效应分子而异。对不太容易被分解的靶点环境应选用裂解性接头,一般来说,采用裂解性接头偶联的ADC或多或少地会在循环系统中脱落,以致造成非靶标性的毒性;反之,对吞噬率相对较高的单克隆抗体或抗体片段还可以采用稳定接头。采用这类接头的ADC对肿瘤靶标的选择性通常较高,因此系统性的毒性会相对较低,有望起到疗效高毒性小的理想效果。(3)连接效应分子的数目。选择不同的接头也会影响连接效应分子的数目:连接药物个数不够直接导致ADC的活性不够,而过多药物导致偶联物半衰期和耐受性的降低,并可能损害抗体对抗原的亲和力。理想的偶联个数每个单抗分子含有2~4个药物。传统的偶联方式主要利用单抗表面的氨基酸残基比如赖氨酸、半胱氨酸等和偶联试剂反应。已经报道通过这个方法可以连接高达16个阿霉素到抗体上,但是这样的偶联物因为聚合而损害了其生物活性。为了降低聚合程度,第一个上市的偶联物gemtuzumabozogamicin每个抗体平均只含有2~3个细胞毒素,实际上按照这个方法制备的偶联物非常不均一,据称有一半抗体实际上没有和药物偶联。偶联技术一直在改良,比如加入一种添加剂可以有效地提高以上calicheamicin偶联的均一性。考虑稳定性、裂解性、水溶性等参数,作者认为对各种抗体和效应分子应用面最广的接头当属缬氨酸-瓜氨酸二肽接头(如MHVCBC,表1)。当然,缬氨酸-瓜氨酸二肽接头还需要嵌合不同水溶性的隔离棒进一步修饰,以符合各种抗体和效应分子的要求。目前采用西雅图遗传生物制药公司mAb-vcMMAE(F)技术的抗体有:BCMA、CD19、CD20、CD70。另外值得注意的是:抗体偶联物领域的一个重要努力是提高接头的循环系统稳定性,但是西雅图遗传生物制药公司的研究人员观察到,一旦ADC的稳定性超过6~7天,进一步提高稳定性在临床前试验中已经无附加优势。尽管ADC每一个组件都可以单独优化,但最终偶联物的特征也有一定个性。基因泰克的研究人员系统地头对头地比较了抗非霍奇金淋巴癌的一系列ADC化合物中抗体、接头对最终ADC的影响。他们发现,在筛选的7种抗CD19、CD20、CD21、CD22、CD72、CD79B、CD180偶联物中,由酶解接头相连的偶联物在动物实验中都显示明显疗效,而由稳定性接头相连的ADC只有针对CD和CD79B的偶联物才表现明显效果。采用稳定性接头形成的ADC安全性要更高一些,可能是由于在循环系统裂解的药物更少,这似乎提供临床上更多的选择。为了深度比较采用硫醚键接头的Kadcyla(T-DM1)和双硫键接头的优劣,基因泰克的研究人员从体外到体内头对头的比较了Kadcyla(15)和T-SPP-DM1的活性、药物动力学特征、标靶效应分子的释放以及疗效。结果发现,尽管这两个ADC化合物在多种体外、体内实验有许多差别,但对DM1的靶向输送效果完全相同。3抗癌药的研发虽然抗体药物偶联物是一个“古老”的概念,但早期的研究没有实质性进展。直到第二代抗体药物偶联物Adcetris和Kadcyla的上市才把开发ADC类抗癌药推向肿瘤研究的制高点。目前几乎所有制药巨头都有ADC在研项目。作者认为,目前开发ADC类新药至少有来自三个方面的挑战。3.1从孤儿药向一线用药的策略单克隆抗体是到目前为止最成熟也是最重要的生物类药之一。在抗肿瘤研究领域,ADC是提高生物抗体药活性最有效的方法。经过几十年的进化,ADC的设计日趋完善,已经成为目前肿瘤研究的重要方向之一。据美中药源不完全统计,到目前为止抗体药物偶联物领域至少有一百个在研项目,其中超过30个ADC化合物已经进入不同阶段的临床试验。ADC类新药研发靶点清楚,技术成熟,是抗肿瘤领域典型和理想的切入点之一。Adcetris(14,brentuximabvedotin,曾用名:SGN-35和cAC10vcMMAE)是西雅图遗传制药公司研发的ADC,在2011年8月19日被美国FDA批准上市,用于治疗间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)和霍奇金淋巴瘤。根据美国FDA网站信息,Adcetris至少正在进行4个临床试验,都是作为一线抗肿瘤用药。其中一个试验是Adcetris联合环磷酰胺、阿霉素和泼尼松(A+CHP),作为一线用药治疗表达CD30的成熟T-细胞淋巴瘤(MTCL)。此外,Adcetris的研发过程也是ADC药物研发的典范。Adcetris的开发采取从孤儿药着手而后扩大适应症的策略,鉴于复发性间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)和霍奇金淋巴瘤缺少有效的治疗手段,而Adcetris在临床试验中取得超过百分之七十的应答,很快取得监管部门的认可。之后,由于二线用药市场有限,Adcetris在上市以后进行了多项一线用药的三期临床,有望在不久将来迅速扩大市场占有率。因为首先开发孤儿药,临床试验的成本相对较低,而成功带来的回报足以投资以后的扩展实验。最后,Adcetris的开发也是个体化治疗的典范,西雅图遗传和Ventana医疗器械公司合作开发CD30配搭诊断试剂盒,用于筛选合格的临床实验对象。第三个或许是目前最重要的一个获得美国FDA批准的ADC新药是罗氏的Kadcyla(15,通用名:adotrastuzumabemtansine,T-DM1)。今年2月22日FDA通过快速审查通道批准了Kadcyla,用于治疗HER-2阳性,对曲妥珠单抗和紫杉醇有抗药性的晚期或转移性乳腺癌患者。ImmunoGen的TAP技术是到目前为止临床上最认可的抗体药物偶联物技术之一,Kadcyla也是唯一一个FDA批准上市的,用于治疗固体肿瘤的ADC。这是美国FDA继曲妥珠单抗(1998年)、拉帕替尼(2007年)和帕妥珠单抗(2012年)以后批准治疗HER2阳性乳腺癌的又一药物。Kadcyla也和Adcetris一样采用从孤儿药着手而后扩大适应证的策略。研究结果证实,Kadcyla在一个二期临床试验中显示作为一线用药能显著延长HER2阳性乳腺癌患者无进展生存期。Kadcyla治疗组无进展生存期的中位数是14.2个月,和曲妥珠/多西他赛对照组的9.2个月相比延长了5个月,具有统计学显著。除此之外,Kadcyla的耐受性似乎更好,三级以上不良反应的发生率为46.4%,显著低于标准组的90.9%。另外,EMILIA三期临床所证实Kadcyla的药理学特征也值得重视。肿瘤病理切片以及之前动物模型实验中的数据显示,对曲妥珠单抗治疗产生抵抗性的患者人群中HER2受体数量和功能均未受到损伤性影响。内脏转移灶肿瘤的消退指明,释放的细胞毒素DM1在细胞内的聚集浓度足以导致细胞因有丝分裂障碍而死亡,并且没有出现曲妥珠单抗单药治疗时经常发生的肿瘤生长迟缓(cytostasis)。这样,Kadcyla的实验结果和最初的设计目标完全一致,既保留了曲妥珠单抗的作用又增加了潜在的细胞毒素药物的效应。Kadcyla的成功至少在两方面表现重要意义:(1)Mylotarg和Adcetris都是靶向血液肿瘤细胞表面抗原(CD33和CD30),到目前为止显示明显疗效的临床实验也局限于血液肿瘤。而Kadcyla是靶向固体肿瘤细胞。理论上讲,固体肿瘤组织更复杂,给ADC药物的渗透造成更多困难;(2)Kadcyla的接头是由稳定的硫醚键连接,被肿瘤细胞吞噬后释放了仍然带有接头片段但具有同等活性的美登素细胞毒素,同时也表明这类ADC药物在细胞外没有释放细胞毒素。Kadcyla明显的临床疗效证明,细胞内或细胞表面裂解接头不是ADC药物设计的必要条件。以上数据表明,Adcetris和Kadcyla的研发过程和结果都堪称完美,一方面对ADC类新药的开发起着重要的推动作用,另一方面对这个领域的新入门厂家也是显然的商业压力。除了这两个成功推出的ADC新药以外,至少有30个其他ADC药物已经处于不同的临床阶段,是进入抗体药物偶联物研发领域的市场挑战。3.2抗药物偶联和小分子新药研发相比,技术上开发抗体药物偶联物的门槛要高得多。除了以上所述ADC药物的设计经验和技术,也要牵扯到批量单抗的生产和纯化,以及和小分子偶联的均一性和可控性。目前这个领域的领头羊都拥有独具特色的ADC技术平台,比如西雅图遗传制药公司的vc-MMAE平台、Immun