牛性别控制技术研究现状及其利用

牛性别控制技术研究现状及其利用

动物性别控制是指在动物出生之前通过人工干预或控制性别，改变动物后代的自然生育比例，并根据人类意愿开展特定性别的家禽生产。在正常的畜牧生产中有许多重要经济性状都与性别密切相关,所以性别控制技术在畜牧生产上具有重要的意义,因而也吸引了许多科研工作者一直为实现家畜性别的人工控制而进行不懈的努力。对于畜禽饲养者来说,都希望优化商品畜群,让特定性别的家畜发挥自己的优势,生产出市场上所需的畜产品。奶牛场主都希望母牛多产雌性犊牛来提高产奶量;在肉牛场中因为公牛生长速度要快于母牛,而且阉公牛肉的市场价格较高,为提高产肉量必须增加公牛的比例,以上这些都可以通过性别控制来完成。近几年来,随着分子遗传学、分子生物学及其他相关学科的发展,家畜的性别控制已发展至分子水平。本文就牛的性别控制技术研究现状及其利用情况进行综述。1牛场:三种不同的繁育方式从1902年McClung提出性别决定理论之后,对于性别决定有了划时代的突破,1990年英国学者Sinclair和Gubby发现哺乳动物(包括人类)Y染色体短臂上靠近常染色体区的35K区域存在的性别决定区(SRY)。同时伴随着人工授精和胚胎移植技术的发展和应用,性别控制的研究出现了高潮。当前牛的繁育方式主要有3种:一是有规模的牛场或地区多采用人工授精的方式;二是一些现代化的饲养水平较高的牛场采用胚胎移植的方式;三是在我国个别畜牧业不太发达的地区仍然保持自然交配的方式。与此相对应的性别控制技术也有3种不同的途径:一是在人工授精前通过对X与Y精子分离以控制性别:二是在胚胎移植前对胚胎的性别进行鉴定以控制性别;三是通过控制外环境来控制性别。饲养者可以根据自己实际情况,选择合适的性别控制技术加以实施,以提高经济效益。1.1x与y精子分离牛染色体的数目为60条,其中58条为常染色体,另外两条为性染色体,即X、Y染色体,一般认为雄性动物胚胎的性染色体为XY型,雌性动物胚胎为XX型。至于Y染色体,只在公牛才含有,因此,精卵结合时精子的类别就决定了牛的性别。X与Y精子之间存在着微弱的生物学差异,关于这方面国内外科技工作者进行了多方面研究。如X、Y精子在体积、密度、电荷、运动性和DNA含量、表面抗原等方面存在差异,从而为分离精子提供了依据。实施X和Y精子的分离再通过人工授精可以有效地达到性别控制的目的。1.2牛肉中的性染色体在胚胎移植时,对移植前胚胎进行性别鉴定,人为地选择某一性别的胚胎移植给受体,可以达到性别控制的目的。牛的两条性染色体的形态与常染色体不一样,其鉴别相对容易。雄性胚胎的性染色体为XY型,雌性胚胎的性染色体则为XX型。利用特异性探针检测法,可鉴别出胚胎的性别,再进行移植。1.3精子在果酒精神病理中所处环境的差异是所产生性别主要是由遗传决定的,即由性染色体与常染色体的对比关系决定。在自然交配的情况下。精子在母牛生殖道运行和受精过程中,所处环境的差异将对母牛所产犊牛的性别产生一定影响。此外,性别决定机制中性染色体理论并非这个机制的全部,外界环境中的某些因素也可能不同程度地影响胚胎性别的发育,从而改变性率比。2牛性别控制的方法和现状2.1x和y精的分离根据精子的特征,目前已设计出了许多分离精子的方法。2.1.1沉降介质的选择X精子的体积较大,DNA含量也比Y精子多3%～4%,故沉淀较快。王亚鸣等利用卵黄、甘氨酸、甘油和乳糖配制比重为1.03～1.04的培养分离液作为沉降介质,分离的精子产雌犊率61%。沉降法是以比重的不同为基础的,X精子与Y精子的比重虽然有所不同,但差异较小,且比重会随精子的成熟情况不同而有所变化,所以沉降法的效果不是十分理想。2.1.2精子电泳法精子膜电荷的大小取决于与核蛋白结合的唾液酸的含量,X与Y精子膜电荷的分布有差异。Shroedom在1932年最早报道了利用电泳法来分离牛的精子,即在一定的酸碱度下,对精液进行电泳。由于Y精子尾部膜电荷量较高,而X精子头部膜电荷较高,当以中性缓冲液电泳时,向阳极运动的多为X精子,游向阴极的多为Y精子。因此,根据精子表面带电荷量不同,通过电泳可以将X与Y精子分离,这种方法一般能获得较高的母犊率。2.1.3x、y精子分离由于X精子密度1.1141g/cm3,而Y精子密度1.1134g/cm3,所以可根据二者在密度上的差异来离心分离。密度梯度法利用蔗糖、乳糖作为介质来对精子高速离心,结果上层多为带F小体的Y精子,下层为不带F小体的X精子,分离后X、Y精子的纯度可达73%～94%。但是密度梯度法较繁琐,而且分离后的X、Y精子比例为55.1:41.1,这一数值虽在统计学上存在显著差异,但在生产实践上并无实际应用价值。2.1.3精子的分离和利用应用免疫学方法分离精子是从发现H—Y抗原后逐渐发展起来的。在组织器官移植实验中,雌性排斥来自基因型相同的雄性的移植体,这表明雄性存在某种特异的细胞表面抗原,被命名为雄性特异性弱组织相容性Y抗原,简称H-Y抗原。现已证明H—Y抗原被保留在整个进化过程中,除了某些过渡品种外,在所有异型配子的性别品种的体细胞中均发现H—Y抗原存在,Zaborski(1979)报道:只有Y精子才能表达H—Y抗原。因而,利用H—Y抗体检测精子质膜上存在的H—Y抗原,再通过一定的分离程序,就能将精子分离成为H—Y+(Y精子)和H—Y-(X精子)两类。将所需性别的精子进行人工授精,即可获得预期性别的后代。谭礼(1985)在骨移植研究中,发现同种或异种个体骨移植成功的公牛血清能凝集部分精子,而一般公牛犊血清对精子不发生凝集现象。贾福德通过对天津市牛育种站提供的种公牛精液应用生殖免疫方法制作性别化的冻精来对牛进行人工授精,发现产母犊率可达60.70%,比自然性比例提高10.70个百分点。目前,H—Y+、H—Y-精子分离的主要方法有:免疫亲和柱层析法、直接分离法及免疫磁力法。免疫法分离精子的效率较高,但经处理后的精子数目少而且活力低,因此很难在实际生产中应用。2.1.5流式细胞仪检测流式细胞仪是进行细胞生物学和肿瘤学、血液学、免疫学等研究的重要工具,它由液流系统、光学系统、分选系统和数据处理系统等组成,能够定量测定精子等多种单个细胞的细胞膜、胞浆以及核内的多种物质,而且具有测定快速、精确、多参数的特点。自20世纪70年代以来,它在临床诊断方面的应用越来越广泛。近几年来,美国农业部农业研究中心繁殖实验室在前期使用流式细胞仪及分选系统进行家畜精子分离的基础上,成功的完成了应用流式细胞仪对通过其它精子技术所获得的定性精液进行再次检测的研究。李慧斌等(2000)利用流式细胞仪检测了牛精液的分离效果,发现未分离原精中X和Y精子的比例以及产犊的性别比例基本均为1:1,而利用富含X精子的定性精液在230头实验后代中得到的雌雄性别比例高达1.64:1,利用富含Y精子的定性精液在145头后代中的雌雄比例为0.75:1。流式细胞法是当前分离X、Y精子较准确的方法,它的理论基础是:X精子的DNA含量比Y精子的高。对于牛,X精子比Y精子DNA含量高3.80%,且染料着色量与精子DNA含量成正比。因此,X精子吸收的染料就多,X精子发出的荧光较强。具体的做法是:先用DNA特异性染料对精子进行活体染色,然后精子连同少量稀释液逐个通过激光束,探测器根据精子的发光强度把电信号传递给计算机,计算机指令液滴充电使发光强度高的液滴带正电,弱的带负电,即X精子带上正电荷,Y精子带上负电荷。当经过高压电场时会向不同方向偏转,达到分离的目的。用分离后的精子进行人工授精或体外受精对受精卵和后代的性别进行控制。此法具有重复性、科学性和有效性的特点,分离准确率高达90%,但是分离速度太慢,会影响精子的活力导致受胎率降低,故此法有待改进。2.2pcr和性别控制技术在进行性别鉴定中的应用由于X、Y精子间的差异不显著,使得直接分离精子困难重重。目前,较理想的家畜性别控制的途径是直接进行胚胎的性别鉴定,现在胚胎移植技术已大量地应用畜牧生产特别是牛生产,根据需要达到选择并移植某一性别的胚胎使之发育也可产生所需性别的后代。截至2004年3月25日,在中国工程院院士旭日干教授领导下,我国研究人员将国外的良种肉牛试管冷冻胚胎通过PCR性别控制技术进行性别鉴定,然后将已确定性别的胚胎移植给受体母牛,5头经性别控制的试管牛犊在内蒙古大学实验动物研究中心顺利诞生,其性别鉴定的准确率高达100%。这是我国首次利用试管牛冷冻胚胎进行性别控制取得的成果。2.2.1牛的胚胎移植前鉴定此法即通过核型分析来完成牛的胚胎性别鉴定。动物胚胎的核型是固定的(XX或XY),有XX染色体的为雌性,有XY染色体的为雄性,这种方法鉴定胚胎性别的准确率几乎为100%,但操作过程较繁琐,操作的时间长,获得高质量的中期染色体分裂较难,对胚胎损坏大。牛的胚胎在移植前可用简单的细胞遗传学技术来鉴定牛的性别。这一技术已经在鼠和绵羊中实验成功。在牛胚胎滋养层上取一小部分细胞,经Colcemid(乙酰甲基秋水仙碱)培养基培养,使有丝分裂停留在中期,通过渗透压使细胞膨胀破裂。释放出染色体并加以固定、染色,检查性染色体,根据染色体在细胞分裂中期的不同谱带和Y染色体的大小、形态来判断性别。此外,近期又逐渐兴起了胚胎分割后进行性别鉴定再移植的方法。其具体做法:对2～8细胞胚胎进行显微操作,用显微操作仪上的玻璃针(或)9片),将每个卵裂球分离成半胚进行切割;或是将桑葚胚或囊胚一分为二或一分为四,并把每块细胞团放入空的透明带内,对其中一块进行性别鉴定,之后再进行移植,最终达到性别控制的目的,其准确率高达100%。2.2.2酶法近些年来由于分子生物学的研究得到不断深入地开展,同时也取得了巨大成就,对于牛的胚胎移植目前也相继出现了几种分子水平的检测方法。2.2.2.pcr和探针检测y染色体存此项技术是上世纪80年代逐渐发展起来的一种方法。该法需首先从雄性的Y染色体上提取一DNA片段,然后用放射性同位素标记作为DNA探针。同时先提取被检胚胎的DNA的同源序列,用PCR扩增后与探针进行杂交,并根据斑点的显示来判断是否有Y染色体的存在。杂交为阳性的是雄性胚胎,杂交是阴性的为雌性胚胎。此法对胚胎进行检测的准确率高达95%。2.2.2.cr扩增法crSRY基因的发现,为胚胎性别鉴定提供了可靠的途径,同时也使PCR技术应用于胚胎性别鉴定成为可能。无论是XY型胚胎,还是XX型胚胎,只要它们的染色体具有SRY基因,那么胚胎就为雄性。PCR扩增法是一种模仿体内DNA复制的过程,它主要是针对牛SRY的DNA序列设计特异引物,并通过PCR扩增胚胎SRY特异DNA序列来鉴定胚胎的性别,电泳后出现扩增条带的SRY为阳性,则判断为雄性胚胎,而无扩增条带的SRY为阴性,则为雌性胚胎。欧阳红生等(1995)用PCR技术对牛胚胎性别进行鉴定,准确率达到100%;王京红等对已知性别的牛的DNA样品进行性别鉴定,并与真实性别作比较,发现结果极为相似。该法因有可靠的操作程序,具有高效、快速的特点,近年来得到迅速的发展。但其最大问题就是污染,因而在操作上要严格操作程序,避免外源DNA片段的污染。2.2.3扩大细胞dna的pcr和荧光把握从培养了7d的胚胎中,取10%～20%的细胞放人含聚乙烯吡咯烷酮的PBS液中。细胞分解后,用PCR扩增其DNA,并在紫外光下观察。雄性胚胎的细胞样品发出粉红色的荧光。检查过的胚胎就可植入母体。Jakma在73枚胚胎中,有39枚为雄性,性别诊断的精确率为92.30%。2.3外来环境差异在对母牛进行人工授精或自然交配时,精子在母牛生殖道中运行至输卵管与卵子结合完成受精过程,在此过程中所处的环境差异对母牛将来产出的牛犊性别比例产生影响。同时,母牛妊娠期间所处的外界环境也对其胚胎性别的发育产生一定影响,并最终改变了后代的性别比例。所以,可以通过控制外界环境而达到性别控制的目的。2.3.1丰富或喂碱饲料时酵母的情况通常在饲料饲喂量不足或饲喂酸性饲料类型时,母牛多产雄性后代;当饲喂量丰富或饲喂碱性饲料时,母牛多产雌性后代。在年龄结构上,年老型的母牛常常多产雄性后代,中年型的母牛多生雌性后代,而对于双亲都为中年牛来说,则多产雌性犊牛。2.3.2抗氧化性因素Y精子对酸性环境的耐受力要弱于X精子,而对碱性环境的耐受力要强于X精子。因而当所用冻精的解冻液或母牛生殖道的pH值低于6.8时,Y精子的活力减弱,运动缓慢,所以失去了与卵子结合的较多机会,最终导致后代雄性牛犊数少;而当pH值大于7.0时,Y精子的活力增强,活动迅速,有较多的与卵子结合的机会。因而后代雄性牛犊多。黑木常青用5%赖氨酸注入牛子宫颈内,引起产母率提高,之后我国的李秀山、胡春山、王瑞山、王念功等将赖氨酸用生理盐水稀释成中浓度,输精前30min向雌性阴道内注入溶液1毫升,取得了产母率55%～72%的结果,证明赖氨酸有使生殖道黏液变酸的趋势,而且酸性环境有利于受精卵合成XX合子,从而提高产母犊率。另外,用激素处理精液,也可调节动物生殖道黏液pH值。弗拉季尔斯卡娅在精液稀释中加入雄性激素,使猪后代雄性达64%～70%;当加入雌性激素,后代有60%的雌性个体。2.3.3在牛人工授精方面排卵前一定时间输精多产雌犊,而在排卵后输精多产雄犊。控制授精时间的方法较简便,但对掌握适时输精的技术要求较高。此外,在牛人工授精技术上,为保证冻精的受胎率,一般推荐在母牛接近排卵时授精。这样和牛性别控制的目的相矛盾,所以要想既保证理想人工授精受胎率,又保证较高生母犊率的适宜授精时间就需要做更多的研究。齐信义研制出“适时授精性别控制仪”