高糖诱导人肾小球内皮细胞il-6、nf-mrna表达及对糖尿病肾病的影响

高糖诱导人肾小球内皮细胞il-6、nf-mrna表达及对糖尿病肾病的影响

糖尿病性肾衰竭（dn）是肾衰竭的主要原因之一。研究表明炎症机制尤其是一些炎症因子过表达是其发生发展的关键因素。传统观点认为,DN的发病过程无免疫机制参与,但近期有较多研究涉及DN与补体的关系。有报道在糖尿病及DN患者肾脏和尿液中检测到高浓度的补体激活终产物——膜攻击复合物(membraneattackcomplex,MAC),提示DN的发病可能涉及补体激活机制。此外,研究发现糖尿病患者及实验动物模型体内存在甘露聚糖结合凝集素(mannosebindinglectin,MBL)水平的明显升高,且与患者的死亡率呈正相关。基于以上研究,我们设想在DN患者体内可能存在MBL途径补体激活。补体激活的终末产物MAC可引起炎症因子表达增加。因此,如能检测到在高糖刺激下内皮细胞表面有MBL和MAC的沉积以及细胞炎症因子表达的升高,将证明DN的发病中MBL补体激活机制的存在,并可将其与DN的炎症机制联系起来。1材料和方法1.1免疫酶n,b人肾小球内皮细胞(HRGEC)、内皮细胞培养基、内皮细胞生长因子(美国ScienCell);重组人MBL、人白细胞介素-6(IL-6)ELISA试剂盒、人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(美国R&D);TrizolReagent、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(美国Invitrogen);BrilliantSYBRGreenmastermix(日本Toyobo);FITC标记的鼠抗人C3单克隆抗体(美国BioSciences);生物素化的鼠抗人MBL单克隆抗体(美国HycultBiotechnology);Streptavidin-PE/Cy5(美国Biolegend);鼠抗人MAC单克隆抗体(美国SantaCruz);FITC标记的羊抗鼠IgG(美国DAKO);EXL808全自动酶标仪(美国BIO-TEK)、ABI7500荧光实时定量PCR仪(美国ABI);EPICS—XLⅡ型流式细胞仪(美国Beckman-Coulter);荧光显微镜(日本Olympus);IL-6、TNF-α、内参GAPDH引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。引物序列及产物长度见表1。1.2糖刺激对hrcg有影响1.2.1浓度接种入孔细胞按常规方法复苏后,加入内皮细胞培养基,置37℃5%CO2培养箱内传代培养,选取第4~6代细胞,按照105/mL浓度接种入6孔板中,每孔2mL。分为3组:正常糖组(5mmol/LD-葡萄糖)、甘露醇组(5mmol/LD-葡萄糖+25mmol/L甘露醇)和高糖组(30mmol/LD-葡萄糖),每组设3复孔。置入培养箱培养24h后,离心分离上清液和细胞,上清液用于ELISA检测,细胞用于实时荧光定量PCR(real-timePCR)检测。1.2.3方法的预实验结果ELISA法测定细胞培养上清液中IL-6和TNF-α的蛋白表达,操作严格按照说明书进行。预实验结果显示,检测IL-6时样品稀释10倍效果最佳,而检测TNF-α时样品无需稀释。在全自动酶标仪450nm波长处检测各组吸光度(A)值,利用标准曲线求出浓度。实验重复3次。1.3通过补体激活对高糖刺激和高血糖刺激的影响1.3.1制备人血清正常人血清中含一定浓度的MBL,为排除这部分MBL的影响,保持各组实验条件的一致性,必须制备MBL缺乏的人血清。制备方法按照文献,采用亲和色谱法将甘露聚糖交联到琼脂糖(Sigma公司),产物用含有Mg2+Ca2+Hanks(HBSS)。1.3.3荧光标记实验细胞培养完毕后消化制成单细胞悬液,调整密度至1×106/mL。加入生物素化的鼠抗人MBL单克隆抗体(0.45μg/106个细胞)及FITC荧光标记的鼠抗人C3单克隆抗体(0.2μg/106个细胞),室温避光孵育30min;PBS洗涤2次,1500r/min离心,加入Streptavidin-PE/Cy5,室温避光孵育30min;PBS洗涤1次,1500r/min离心,重悬细胞于300μLPBS中上机检测。设本底对照和阴性对照。检测前以鸡血红细胞作为标准样品调整仪器变异系数(CV)值在2%以内。实验重复3次。1.3.4温室模拟培养制备细胞爬片,冷丙酮固定20min。加入鼠抗人MAC单克隆抗体(1∶50)室温避光孵育1h;洗涤后加入FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶70),室温避光孵育45min,洗涤,固定液覆盖固定10min,免疫荧光封存液、盖玻片封片,荧光显微镜下观察照相。1.3.5il-6和tnfmrna和蛋白质检测1.4方差分析和q检验计量资料以x±s表示。1.2部分各指标的组间比较采用方差分析和q检验,1.3部分各指标的组间比较,方差齐时采用独立样本均数t检验,不齐时行数据对数变换(X=lgX)使其方差齐。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1高糖组与对照组il-6和tnf-mrna表达比较高糖组IL-6和TNF-αmRNA相对表达量分别为正常糖组的1.77倍和2.23倍。高糖组与其余两组相比,IL-6和TNF-αmRNA表达增高,差异有统计学意义(P<0.05)。甘露醇组与正常糖组相比,IL-6和TNF-αmRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。2.2高糖组与其他两组il-6和tnf-蛋白表达的比较ELISA法检测细胞培养上清液中的IL-6和TNF-α蛋白浓度,高糖组与其余两组相比,IL-6和TNF-α蛋白表达增高,差异有统计学意义(P<0.05)。甘露醇组与正常糖组相比,IL-6和TNF-α蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。2.3不同高糖组不同部位mbl和c3沉积阳性率的比较经流式细胞技术检测,高糖+MBL组MBL和C3共沉积的阳性率为6.1%,C3沉积阳性率为8.5%。而单纯高糖组MBL和C3共沉积阳性率为0,也无明显C3沉积。其余两次检测结果类似(共沉积阳性率两组分别为5.3%,0.1%;6.0%,0)。见图1。2.4mac细胞表面免疫荧光染色可见高糖+MBL组细胞膜上有明显黄绿色MAC荧光复合物沉积,单纯高糖组未观察到明显荧光信号。见图2。2.5通过补体激活对高糖刺激il-6和tnf-i的影响3补体机制与炎症机制的上下游关系DN是糖尿病的重要微血管并发症,肾小球内皮细胞功能障碍与之密切相关。内皮细胞在小球固有细胞中所占比例最大,糖尿病早期即可受累。慢性低度炎症在DN发生发展中发挥重要作用,其中某些炎症因子的过表达是极重要的机制。对体外培养的脐静脉内皮细胞的研究表明,高糖可以诱导IL-6、TNF-α等炎症因子的过表达,但国内外少见可以直接显示肾脏受累的关于HRGEC的研究。本研究利用高糖培养的HRGEC的结果显示,高糖可使细胞IL-6、TNF-αmRNA和蛋白表达明显增加,直接在HRGEC证实了高糖对炎症因子表达的诱导作用。IL-6是炎症介导DN的重要因子,在1、2型糖尿病患者,尤其是有肾损害患者的血清和组织中浓度明显增加,且随肾病的严重程度而升高。TNF-α在DN患者的血清、尿液及外周血单核细胞中均有升高,且与1型糖尿病患者的肾小球滤过率(GFR)密切相关,可增加肾小球血管通透性,刺激血管外基质过量产生和内皮细胞增殖,在糖尿病微血管并发症的发展中发挥重要作用。本研究结果表明,高糖可以造成小球局部炎症状态,促进DN进展,这为加强血糖控制治疗提供了更多的依据。近年来DN的发病机制研究又有了新发展。多项大规模临床研究证实,MBL补体途径与DN之间存在密切联系。在1、2型糖尿病及DN患者中均发现MBL明显升高,且与疾病的严重性呈正相关。动物实验也表明,MBL基因敲除可以减轻糖尿病动物模型的肾功能损害和形态学改变,肾脏损害与MBL有关。补体激活过程中,补体成分首先沉积在其攻击物的表面,再发生级联反应。本研究采用流式细胞技术观察到MBL刺激下高糖培养的HRGEC表面MBL补体途径的启动物质MBL和中间反应物C3的明显共沉积,显示已经发动MBL补体激活进程。用免疫荧光技术观察到细胞表面黄绿色补体激活产物MAC的明显沉积,表明高糖刺激下MBL和C3共沉积后,有MAC的装配形成和沉积。这样就从整个MBL补体激活途径的3个关键部位证实了高糖+MBL组MBL途径补体激活的存在,而单纯高糖组无此现象。MAC具有细胞毒和促炎作用,可以介导炎症因子表达增加和糖尿病患者慢性炎症状态的发生。MAC插入细胞可引起一系列炎症因子释放,如TGF-β、TNF-α和白细胞介素等;还可刺激氧自由基,促使信号转导途径启动,从而调节细胞生长、增殖和凋亡。实验结果显示,高糖+MBL组与单纯高糖组相比,IL-6、TNF-α的mRNA和蛋白表达均增加。IL-6与TNF-α均是炎症介导DN的重要因子。总之,高糖与MBL共存时,MBL可以在内皮细胞表面沉积,激活补体,形成MAC,导致炎症因子释放。这样就将补体机制与DN炎症机制联系起来,并证明二者之间存在一定上下游关系。综上,本研究证实了高糖对HRGEC表达炎症因子的诱导作用并首次在体外培养的HRGEC中证实MBL途径补体激活机制对DN的致病作用,并证明补体机制与炎症机制之间存在一定上下游关系。补体激活等免疫因素参与糖尿病微血管病变的机制一旦被更多的实验室和临床证据证实,必将为DN的防治提供崭新的策略。1.2.2pcr扩增参数收集细胞,Trizol法提取总RNA,取1μg按试剂盒说明书逆转录成cDNA。Real-timePCR反应总体系为25μL,包括:13μL1×SYBRMix,1μLPCR上游引物(0.2μmol/L),1μLPCR下游引物(0.2μmol/L),7.5μLddH2O,2.5μLcDNA。以GAPDH为内参照。PCR扩增参数:95℃预变性10min;45个循环:95℃变性15s,63℃退火10s、延伸17s实验重复3次。PCR完成后,在ABIPrismSDS2.0软件上进行自动分析,查看每个基因的扩增情况,导出相应的循环域值(Ct),校正cDNA模板的细胞拷贝数,计算相对量采用2-ΔΔCt法,ΔΔCt=[CtGI(未知样品)-CtGAPDH(未知样品)]-[CtGI(校正样品)-CtGAPDH(校正样品)],平均相对含量(RQ)=2-averageΔΔCt×100%。1.3.2il-6和tnf-mrna表达量检测预实验中我们采用流式细胞技术证实,高糖(30mmol/L)培养HRGEC24h后加入1μg/mLMBL作用4h左右细胞表面MBL和C3的沉积达峰值。取内皮细胞,按105/mL浓度接种入6孔板中,每孔