脑缺血再灌注损伤致神经血管单元死亡和凋亡的分子机制

脑缺血再灌注损伤致神经血管单元死亡和凋亡的分子机制

中风病变是临床医学的难题。近年来，随着血管重建的推进，以及缺席矩阵反应两个机制的治疗和药物开发，药物的临床效果并不理想，药物开发的概念也得到了认真解决。中医药具有多组、多中心、多目标、多层次的优势。如何结合国内外关于神经血管网络药理学的最新研究成果，以及中药和有效成分组的理论，对中医数据库中的创新药物开发具有重要意义。1基于神经血管单元理论，分析了脑损伤后的治疗目标1.1脑缺血损伤的病理及结构脑卒中是危害中老年人生命与健康的常见病,具有高发病率、高致残率、高复发率及高致死率的特点,脑卒中分为缺血性卒中和出血性卒中2种类型,脑卒中神经病变(CIN)是其共同病理特征之一。国际上多年来主要针对神经元保护进行抗脑卒中创新药物研制,效果不理想,10多年来美国FDA仅仅批准了一个相对有效的药物上市,其原因可能是单细胞、单靶点思路阻碍了药物的成功率,近年来的神经血管单元理论为创新药物开发提供了新的思路。神经血管单元(neurovascularunit,NVU)是美国国立神经病学与卒中研究所(NINDS)提出的一个中风治疗的概念模型,是神经系统的结构和功能单位,由神经元、血脑屏障(bloodbrainbarrier,BBB)、小胶质细胞(microglia)以及维持脑组织完整性的细胞外基质构成,BBB的组分包括星形胶质细胞、血管内皮细胞、周细胞(pericyte)和基底膜。脑缺血损伤与神经元、小胶质细胞和微血管关系密切,符合网络药理学理论。因此,对NVU相关的“靶点网络”进行药物开发可能会为脑卒中神经病变的防治带来新的机遇,我国一些医药研究机构利用该技术研究创新药物已经取得了一系列进展。1.2各类主体结构的作用在缺血脑再灌注损伤中至少有3种基本机制:兴奋性毒性和离子失衡、氧化/硝基化应激、细胞凋亡。脑缺血导致能量丢失而促发离子稳态失衡和神经递质(如谷氨酸)的释放及再摄取抑制。过量谷氨酸结合到离子型N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDA)和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸(AM-PA)受体上加速了钙内流,进而导致了线粒体上的磷脂酶(主要是磷脂酶C和磷脂酶A2)、钙依赖蛋白酶及一氧化氮合酶(NOS)等活化,改变线粒体膜的通透性,并诱导生成大量氧自由基引起膜脂质过氧化等一系列自由基连锁反应等进而导致细胞死亡或凋亡。近年来AMPA受体的作用日益受到关注,研究发现一种含有PDZ和BAZ结构域的功能性伴侣蛋白PICK1(proteinthatinteractswithCkinase1)在AMPA受体的上膜、转运和酸敏感离子通道(ASIC)的膜定位分布扮演了极为重要的角色,PICK1可能成为缺血性脑损伤的新靶点。另外,胞内Ca2+的其他通道,如L,P/Q和N型钙通道都是抗脑卒中的潜在靶点。1.3caspases家族在脑卒中病例中,凋亡主要出现在缺血半暗带。凋亡程序的触发器包括过量的氧自由基生成、Bid分裂、DNA损伤、死亡受体连接及溶酶体蛋白酶激活等。研究发现多种调节基因产物参与细胞凋亡过程,如半胱氨酸蛋白酶(Caspases)家族、Bcl-2家族、c-Myc及p53等。其中Caspases家族在凋亡过程中起关键作用,Caspases的酶原经蛋白水解酶而激活,激活的半胱氨酸蛋白酶又可作用于其自身和其他半胱氨酸蛋白酶原,依次激活其他半胱氨酸蛋白酶,形成信号传导机制的酶级联反应,最终导致细胞凋亡,其中多个环节蛋白可能成为未来的药物靶点。在主要已知的细胞凋亡途径中,线粒体目前是最重要的机制之一。线粒体包含了一系列促凋亡因子,包括细胞色素C、继发性线粒体源性Caspase激活因子(secondarymitochondrialactivatorofcaspase,Smac/Diablo)、核酸内切酶G、细胞凋亡诱导因子(apoptosisinducingfactor,AIF)等。1.4信号转导通路脑卒中参与神经病变信号转导的主要有以下几条通路:促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPK)信号转导通路,其中又以胞外信号调节蛋白激酶(extracellularsignal-regulatedroteinkinase,ERK)通路、c-jun-N端激酶(c-junnterminalkinase,JNK)通路和p38MAPK通路研究的最为广泛;磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-3kinase,PI-3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine/threoninekinase,Akt)(PI-3K/Akt)信号转导通路;Janus激酶-信号转导和转录激活子(Januskinasesignaltransducerandactivatortranscription,JAK/STAT)信号转导通路;核因子κB(nuclearfactor-kappaB,NF-κB)转录因子参与的信号转导通路;蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)等。虽然多数信号转导通路在神经元、星形胶质细胞及血管内皮细胞被激活,但它们的表达呈现出不同的时程变化,发挥的作用也不尽相同,并且不同的信号转导通路之间可相互影响。2分析神经血管单元三个细胞的潜在药物目标2.1神经调节素—神经元保护的潜在药物靶点缺血后再灌注可快速导致炎性细胞因子的表达,如肿瘤坏死因子(TNF),白介素-1(IL-1),IL-6,IL-8,IL-10等,继发的反应包括其他的细胞因子的释放,细胞间黏附分子表达的上调以及免疫反应成分的变化等,引起继发的神经元损伤。神经元兴奋时多巴胺的毒性作用主要包括:多巴胺自身的神经毒性、多巴胺代谢产物的神经毒性、增强兴奋性氨基酸的毒性、诱导神经元凋亡等。近年研究发现,脑缺血晚期给予L-型钙通道激动剂有明显的神经保护作用;抑制大电导钙依赖的钾通道(BKCA)通道功能活动对神经元具有保护作用;神经调节素-1(NRG-1)可通过突触前ERBB4受体促进GABA的释放,从而发挥神经保护作用。因此激活L-型钙通道、抑制BKCA通道及激活ERBB4受体可能成为潜在的神经保护新靶点。2.2潜在的药物目标2.3血管内皮保护因素脑微血管保护靶点应该在脑缺血再灌注病理生理机制的背景环境下来评价,可以分急性(数小时)、亚急性(数小时至数天)以及慢性阶段(数天至数月)。在脑卒中急性期,血管保护措施的主要损伤因素包括:氧自由基、内皮素1(ET1)等。而保护因素包括:NO、血管内皮生长因子(VEGF)以及血管生成素1(Angiopoietin1)等。在脑卒中亚急性期,血管内皮细胞产生IL-1β,TNF-α,以及激活转录因子如缺氧诱导因子1(HIF-1),NF-κB,IFN-1等因子。同时一些对血管具有损伤和保护作用的蛋白因子及其相关受体也被激活,如可降解基底膜及破坏内皮完整性的基质金属蛋白酶2和9(MMP-2,MMP-9)表达上调;VEGF,angiopoietin-2和bEGF及其相应受体也被激活。利用药物调节以上环节,可以发挥微血管内皮细胞的保护作用。3细胞死亡和凋亡根据国内外研究进展,脑卒中神经病变的发生发展具有多因素、多机制共同作用的特点,缺血再灌注损伤导致神经血管单元细胞死亡和凋亡的通路有:炎性因子-MMPs通路-Caspases通路;Ca2+-线粒体通路-Caspases通路;Ca2+-磷脂酶-PI-3K/AK通路;Ca2+-自由基-MAPK通路;Ca2+-NO-蛋白酶通路。其中前2个通路的重要节点是Caspases,后4个通路的重要节点是Ca2+和NO。同样,相关治疗药物,绘制了成图1。4脑缺血再灌注网络病理学的意义虽然国内外研究者认识到脑缺血再灌注损伤机制的复杂性,也认识到多靶点策略的合理性和中药的优势,但是对于如何利用最新理论和技术从中药资源宝库中开发抗脑卒中神经病变的多靶点药物仍然缺乏理想对策,研究进展缓慢,亟待突破。网络药理学(networkpharmacology)是在系统生物学和系统药理学基础上,选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科。一方面通过网络分析,鉴定可产生满意治疗的关键节点或节点组合,另一方面指导研究者发现可干扰这些节点、产生多向药理学效应的先导药物。网络药理学将药-靶网络与生物网络整合在一起,从多靶点的研究策略出发,将有利于扩大现有可用药物靶点空间,是发展创新药物的重要途径和新策略。总之,本文在既往研究成果的基础上,分析脑缺血再灌注对神经血管单元细胞死亡和凋亡的信号通路,一方面有助于网络药理学的计算机研究,为网络药理学的网络分析提供重要参考,另一方面有助于围绕神经血管单元的潜在治疗靶点建立细胞水平的模型,为网络药理学计算结果提供验证。脑缺血后胶质细胞作为中枢神经系统第一类受损的细胞,出现肥大、增殖,并合成表达多种炎症介质,形成复杂的“细胞因子网络”共同调控细胞功能。胶质细胞还可以通过释放谷氨酸调节突触