小分子干扰rna和反义寡核苷酸技术的比较

小分子干扰rna和反义寡核苷酸技术的比较

0总结1dana和ason的作用机制1.1碱基特异性序列设计ason-crick碱性遗传因素的具体序列与waton-crick碱性遗传因素混合，以抑制或阻断mrna基因的出现。理论上,人类基因组中只能出现一次的核苷酸序列数目平均为13个。基于这一点,一般设计15~25个碱基特异序列的asON,能针对人类基因组中任何的单个基因作为靶点,从而调控基因表达。迄今为止,asON的作用机制尚未完全清楚,但现在已经明确的机制为:asON严格按Waston-Crick碱基互补配对原理,定向互补到靶mRNA,形成的mRNA-DNA双链,激活RnaseH,水解该mRNA,阻断mRNA进入细胞浆,使其蛋白质的翻译过程不能正常进行,从而阻断了翻译过程,这是asON发挥作用的一条重要机制。1.2sirnas-risc成像siRNAs通过与eLF2c、Gemin3和Gemin4等蛋白结合形成沉默复合体(theRNA-inducedsilencingcomplex,RISC),RISC在siRNAs的反义链介导下,特异性的识别和降解目标mRNA。SiRNAs与目标mRNA靶位点的结合是一个高度序列特异的过程,遵循Waston-Crick碱基互补配对原理。一旦结合,目标mRNA将会在siRNAs与目标mRNA结合处的中点裂解。尽管,siRNAs和asON技术的作用机制不尽相同,但它们都是通过Waston-Crick碱基互补配对原理和目标mRNA结合。2sirnas及ason研究发现,设计siRNAs和asON的序列是有章可循的,一个高效的siRNAs或asON是通过严密的实验,精心选出来的。如何确定siRNAs和asON的序列是siRNAs和asON疗法应用的重中之重。2.1使用目标的mrna一种asON是否有很强的作用效果,很大程度上取决于这种asON能否有效的和目标mRNA结合。mRNA分子不仅具有一级结构,而且有高度折叠的二级及三级结构。这样,asON和mRNA的结合靶点,一定是mRNA分子二级结构中折叠不是很紧密并且结构相对松散的位置,即指mRNA高级结构上能被反义核酸识别并结合的位点(可接近位点,accessiblesite)。目标mRNA的局部空间特性(二级结构)影响asON的生物学作用的效果。找到高效mRNA可接近位点是成功设计特异高效asON的关键。针对这一技术难题,国内外许多实验室投入了大量的财力和物力研究如何在mRNA上选择可接近位点。现有的筛选靶位点的技术主要分两大类,即mRNA的实测分析和mRNA的计算机理论模拟分析。siRNAs与目标mRNA靶位点的结合和反义核酸一样首先表现出对靶位点序列具有专一性,即序列特异性,只有碱基配对完全互补的序列片段才能发挥作用。当存在1~2个碱基不匹配时,便足以使siRNAs丧失与靶mRNA的结合能力。随着研究的深入,人们发现,同asON一样,目标siRNAs的生物学作用效果受mRNA的二级结构影响,并且在某种程度上,siRNAs和asON的作用机制有相似性,它们的生物学活性都依赖于目标mRNA的二级结构。2.2sirnas的可接受程度分析用RnaseH裂解法来选择靶mRNA的asON可接近位点,是一个被普遍接受的策略。RnaseH是一种细胞内普遍表达的核酸内切酶,它能够识别DNA-RNA杂交双链,并水解其中的RNA链。RnaseH裂解法的原理是将一个随机或半随机的寡核苷酸库与mRNA进行杂交,然后用RnaseH消化DNA-RNA杂交分子。对所得到的消化片段进行分析,就可定位可接近位点。由于RnaseH在体外及体内反义效应中均有生物学活性,因而使RnaseH裂解法得以广泛应用。那么用RnaseH裂解法选择的mRNA的asON可接近位点,是否是siRNAs的可接近位点呢?Vickers等首先根据RnaseH裂解法选择的mRNA的asON可接近位点,设计siRNAs序列。然后用设计好的siRNAs作用目标mRNA,结果发现,通常情况下,如果目标mRNA上的位点对用RnaseH裂解法选择的asON没效,其同样对相应的siRNAs没效。但是如果目标mRNA上的位点是RnaseH选择的asON可接近位点,它一定是siRNAs的可接近位点。但是Vickers等同时注意到,有些位点虽然对RnaseH选择的asON没效,但是对相应的siRNAs有效,并且反之亦然。这种差异产生的原因可能在于asON和siRNAs分别作用于mRNA前体和mRNA。由于mRNA前体和mRNA一级结构的轻微差异,导致于mRNA前体和mRNA的二级结构不同,产生了上述的差异。2.3权利抑制剂的确定如果说用RnaseH裂解法可以在目标mRNA上初步选择asON可接近位点,那么用寡核苷酸阵列法则可以在目标mRNA上选择最佳的asON接近位点。所谓寡核苷酸阵列法是在一个固相支持物如玻璃板上,原位合成与靶mRNA互补的所有可能的序列,或通过序列布阵,构建一个寡核苷酸阵列或寡核苷酸芯片。将此阵列与标记的靶mRNA杂交,经扫描分析即可确定杂交反应的位点。据此设计的反义核酸的活性与RnaseH分析结果及体外反义活性间有良好的相关性,且这种寡核苷酸的50%抑制浓度要较以上方法设计的寡核苷酸低5倍。用寡核苷酸阵列法选择的mRNA上的asON可接近位点,同时也是siRNAs的可接近位点。Bohula等先用寡核苷酸阵列法确定胰岛素样生长因子1受体(type1insulin-likegrowthfactorreceptor,IGF1R)mRNA上的asON可接近位点,然后以此为根据设计asON和siRNAs的序列。然后将设计好的asON和siRNAs的序列分别转染给细胞,观察用寡核苷酸阵列法确定的asON或siRNAs是否抑制IGF1R的表达。结果发现,同asON一样,与选择的可接近位点有同源性的siRNAs序列能够很好的抑制IGF1R的表达;而那些和选择的可接近位点没有有同源性的siRNAs序列,不能抑制IGF1R的表达。2.4pcr预测mrold的结构通过计算机软件分析目标mRNA的二级结构,从中选择asON的可接近位点,确定高效asON的序列,这一直是科学家所追求的目标。因为其操作简便快捷,费用低廉。当前有多种计算机软件用于分析RNA的二级结构,如RNAdraw、RNAstructure3.71、RNAViz2.0和mfold等。其中最常用的是mfold软件,其根据形成碱基对或单环的热动力学数据,计算mRNA整个分子的最小自由能,从而预测出mRNA分子最理想的二级结构和亚理想的二级结构。尽管有人用mfold软件成功的预测出一些mRNA分子的最理想二级结构,但是这种软件存在不足。Zuker和Jacobson用mfold软件预测不同16smRNA的二级结构,然后将结果同已知的16smRNA的二级结构相比较,结果发现,预测的结构和已知结构之间的一致性在27%~70%之间,平均值为49%。如果在分析前,明确了RNA螺旋结构或局部构象,则已知的结构和预测结构之间的一致性就可提高到80%。当mRNA分子长度小于700nt时,mfold预测的mRNA分子的最小自由能结构,通常能够预测出73%的已知碱基对的结构。因而,随着mRNA分子长度的增加,预测结构的可信性会更低。Sohail等将cyclinB5mRNA的不同长度转录链(175nt、336nt、512nt、1291nt和1389nt)与以其mRNA第114nt至224nt为序的寡核苷酸阵列杂交。结果发现,在短转录链中存在的某些可接近位点,在长转录链中未发现,但是最强的可接近位点则在所有的转录链中都存在。由mfold软件预测的结构发现不同长度mRNA有着不同的二级结构,且它们之间相似的部分很少。寡核苷酸阵列杂交与预测的二级结构之间相关性最好的是175nt的转录链,而这种转录链出现在转录的早期阶段,其他较长转录链则没有这样的相关性。这说明在转录早期形成的相对稳定的局部二级结构,在整个转录过程中也会保持它的相对稳定性。这些结果暗示,用mfold软件预测mRNA的二级结构有一定的局限性。针对mfold软件的弱点,Patzel等提出了自己的观点,指出了如何利用mfold软件预测mRNA上的asON可接近位点。该方法虽然存在不足,但具有很大的实用性。Schubert等用mfold软件结合RnaseH裂解法预测目标mRNA的可接近位点和不可接近位点,然后根据预测结果,设计siRNAs的序列,结果发现针对可接近位点设计的siRNAs能10倍的抑制目标mRNA的表达。Schubert等用mfold软件预测目标mRNA可接近位点的方法是在Patzel等的方法上做了些改动,具有更大的实用性。呈上,尽管siRNAs和asON的作用机制不尽相同,但它们都是通过Waston-Crick碱基互补配对原理,完成与目标mRNA的识别和相互作用。这决定了它们具有以下共性:(1)他们与目标mRNA结合具有特异性。即使只有一个碱基错配,也不能对目标mRNA产生基因封闭作用。(2)目标mRNA的二级结构对siRNAs或asON的生物学效应影响很大。用实测分析或计算机理论模拟分析预测mRNA的asON可接近位点,同样是siRNAs的可接近位点。3化学修养和一般分类3.1ason/mna的修饰和双链激活相对RNA分子,DNA分子更容易合成并且费用更便宜,这些导致了至今仍有大量科学家把目光放在asON的研究中。对asON的理想化学修饰,是能增加asON和目标mRNA上选定的核苷酸序列有效结合,并且允许RNaseH和asON/mRNA的杂交双链结合促使目标mRNA裂解,同时又增加asON对核酸内、外切酶的稳定性,从而增加进入细胞内的asON的存留时间。为了提高asON的稳定性,增加与mRNA结合的解链温度。人们又把精力集中在对核糖和核苷酸间结合键基的修饰上。将核苷内部的磷酸基上的1个无横越的氧原子用硫原子取代,这就产生了磷硫酰修饰的asON(PS-DNA)。同天然的DNA相比,PS-DNA对核酸内、外切酶的稳定性有了适当的提高,保持了asON/mRNA的杂交双链激活RNaseH的能力。但是PS修饰降低了asON/mRNA杂交双链的解链温度,硫原子增加了其与细胞内或细胞外蛋白的非特异性的结合。这样,为了增加asON/mRNA杂交双链的解链温度,科学家试图修饰核苷酸,使PS-DNA的中心轴位于核苷酸的侧方,增加asON与mRNA结合的解链温度。这就产生了2’-O-烷基修饰(2’-O-alkylmodification):2’-O-甲基和2’-O-甲氧乙基(2’-O-methyland2’-O-methoxyethylgroups)。这一修饰有效的提高了asON/mRNA杂交双链的解链温度,但同时也降低了asON/mRNA杂交双链激活RNaseH的能力。经过不懈努力,科学家终于找到了一个更好的解决办法。他们以D-阿拉伯糖为基础构建RNA的立体异构体(β-D-arabinonucleicacid-ANA)。当ANA被带有氟的羟基修饰后,一种新型稳定的asON:2’F-ANA(2’-deoxy-2’-fluoro-β-D-arabinonucleicacid)诞生了。同天然DNA和PS-DNA相比,2’F-ANA更容和目标mRNA结合,能有效地激活RNaseH,并且有更好的稳定性。3.2单链反义sirnas活力siRNAs一般是指含21~23个碱基的双链RNA。但是当发现单链siRNA也可以抑制目标mRNA的表达时,siRNAs的概念被扩展为含21~23个碱基的单链或双链RNA。Xu等在不同的细胞系中,用单链和双链siRNAs,作用不同mRNA的不同作用位点,检验它们RNAi的作用能力。结果发现,双链siRNAs比反义的单链siRNAs更有活力。并且发现,当把单链正义siRNAs转染给只被单链反义siRNAs作用的细胞系时,单链反义siRNAs就具有了和双链siRNAs相同的活力。和单链的反义siRNAs相比,双链siRNAs能10~100倍地增加RISC的形成。增加单链反义siRNAs的稳定性并不能增加单链反义siRNAs的活力。这些结果暗示,双链siRNAs本身的双链结构是其比单链反义siRNAs活力强的原因所在。3.3双链siRNAs和修饰asON作用特点的比较双链siRNAs和第二代asON对体外培养细胞的作用时间是相同的,被作用的mRNA恢复表达时间一般为4~6d。而被第一代asON作用的体外培养细胞的mRNA恢复表达时间一般为24~48h。Vickers等研究结果同时提示,双链siRNAs是在细胞质和成熟的mRNA相互作用,而asON是在细胞核中与mRNA的前体相互作用。双链siRNAs和修饰asON对目标mRNA的抑制效果和能力是相同的。经过修饰的双链siRNAs,其作用时间和药效都会增加。在所有修饰方法中,2’-O-甲基或2’-O-甲氧乙基修饰是最具吸引力的。和其他修饰相比,2’-O-甲氧乙基修饰能提高dsRNAs寿命,并且相对毒性很低。当然,修饰好的asON,同siRNA一样,能被高效地被导入细胞内,并有效地和靶目标mRNA结合,同样有效的抑制靶目标的表达。4利用sirnas的特异性和作用对k-rasv112基因表达的影响肿瘤经常是由于癌基因过度表达或抑癌基因失控而导致的细胞恶性增生。可以用siRNAs,在体内特异地封闭这些基因的表达,达到治疗作用。Wilda等在转染了BCR/ABL融合基因的K562细胞上,将siRNAs同STI571(现在临床上用的小分子治疗慢性髓细胞样白血病药物)进行了等效研究。结果发现,siRNAs有效的抑制BCR/ABL融合基因mRNA的表达,同时诱导细胞凋亡,治疗效果不亚于STI571。含有valine-112癌基因突变的K-RAS基因(K-RASV112)能够不断激活RAS导致胰腺癌和直肠癌的发生。体外试验发现,针对K-RASV112基因表达mRNA的siRNAs,能有效地抑制K-RASV112基因的表达,同时抑制表达该基因细胞的生长。Cheng等通过体外试验成功的用siRNAs抑制了人肝癌细胞中的乙肝病毒的X蛋白(TheXproteinofhepatitisBvirus-HBx)的表达从而大大抑制了人肝癌细胞的增殖。体内异体动物肿瘤模型实验也进一步证实了这一结果。Jia等通过siRNAs特异性地抑制了视网膜母细胞瘤的异体动物模型的血管内皮生长因子的表达,从而有效地抑制了肿瘤的生长。肿瘤细胞诱导的免疫耐受也是长期困扰临床医生的一个难题。Zheng等用针对IDO(肿瘤自身产生的诱导肿瘤耐受的蛋白)的特异siRNA,有效的抑制了动物模型的肿瘤细胞的生长。有时机体肿瘤细胞会对化疗药物会产生耐药性。Spee等正尝试性地用RNAi方法来解决这一问题。他们用胆管癌细胞系(bile-ductepithelia-BDE)、乳腺癌细胞系(mammarycarcinoma-P114)和骨肉瘤细胞系(osteosarcoma-D17)作为研究目标,通过siRNA特异性的干扰肿瘤细胞的XIAP(抗细胞凋亡蛋白)的表达,有效地增加这些细胞对阿霉素和TRAIL等化疗药物的敏感性。Zou等通过特异性的siRNA干扰了CD147(细胞外基质金属蛋白酶诱导因子-EMMPRIN)的表达,成功的降低了人卵巢癌细胞系(HO-8910pm)侵袭性生长性(体外试验)和肿瘤在裸鼠上的生长,同时增加了HO-8910pm对化疗药物紫杉醇的敏感性。Wang等用前列腺癌细胞系PC-3cells作为研究对象,得出了同样的结果。现在科学家已经开始在多种肿瘤细胞系上应用siRNAs,观察RNAi的疗效。相信不远的将来,医生会像用化疗药物一样,将siRNAs用于临床的肿瘤治疗。5碱基调控rna现在,siRNAs逐步取代asON,已经成为分子生物学研究领域和分子医药前沿的热门工具。研究asON的成功经验,对研究siRNA