川白萸中3种香豆素含量测定

川白萸中3种香豆素含量测定

白鼠尾是一门辩证的学科，具有知县和萧山的作用。ethook.f.或杭州慈海a.dahuric（f.a.）尚胡姆，ethook.f.var.var.m（boiss.）shan和yuan的干燥根具有解外寒、驱风止痛、通鼻、除湿、止痛、排脓等功效。白芷作为常用中药收载于《中国药典》2010年版一部,定量指标仅欧前胡素一项。异欧前胡素、氧化前胡素也是白芷中的主要活性成分且含量较高,应同时作为其质量控制的指标才更具合理性。虽然有文献报道采用HPLC测定白芷中欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素的含量,但由于缺乏其中的对照品及分析成本过高等原因,限制了多指标成分进行质量控制的外标法的实际应用。“一测多评”法作为一种对多指标质量控制的有效方法,克服了对照品短缺这一问题,即只测定某个代表性成分(易得、廉价、有效),同时可计算出其他待测有效成分的含量,是一种适合中药特点的多指标质量评价的新模式。本实验以欧前胡素对照品作为内标物,建立其与氧化前胡素、异欧前胡素的相对校正因子进行含量计算,并考察方法耐用性及系统适用性,以探讨“一测多评”法在川白芷多指标质量控制中应用的适用性及可行性。1药品、化学品与药品Agilent1100高效液相色谱仪,Agilentchemstation工作站(美国安捷伦公司);ShimadzuLC-20A高效液相色谱仪,LCsolution工作站(日本岛津公司);KQ-100型数控超声机(昆山市超声仪器有限公司)。对照品欧前胡素、异欧前胡素均购自中国药品生物制品检定所,批号分别为110826-200712,110827-201008,氧化前胡素为实验室自制,HPLC(面积归一化法)测定纯度>98.5%。甲醇为色谱纯,水为高纯水,其余试剂均为分析纯。川白芷药材均采自主产地四川省遂宁市、达州市的不同区域,共20批,经成都中医药大学张艺研究员鉴定为伞形科植物杭白芷A.dahuricavar.formosana的干燥根。2结果与分析2.1方法研究2.1.1流动相-水法DikmaDiamonsilC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相甲醇(A)-水(B),梯度洗脱0~5min,55%~65%A;5~12min,65%A;12~30min,65%~83%A;流速1.0mL·min-1;柱温30℃,检测波长250nm。上述色谱条件下,各组分分离度良好,见图1。2.1.2混合对照品溶液精密称取欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素适量,加甲醇制成质量浓度分别为0.133,0.042,0.127g·L-1的混合对照品溶液。2.1.3超声强化处理取药材粉末(过40目筛)约1g,精密称定,置于50mL锥形瓶,精密加入甲醇25mL,称重,超声处理40min,放冷,用甲醇补重,摇匀,滤过,取续滤液经0.45μm滤膜滤过,即得。2.1.4进样分析精密吸取上述混合对照品溶液2,5,10,15,20μL,进样分析,每个浓度进样3次,取平均值。以进样量对峰面积积分值进行回归处理,得欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素的回归方程,结果表明各化合物在相应范围内线性关系良好,见表1。2.1.5采用回归因子计算以欧前胡素为内标,按公式,计算欧前胡素对异欧前胡素、氧化前胡素的相对校正因子,结果见表2。2.1.6仪器精密度试验精密吸取同一混合对照品溶液10μL,连续进样6次,记录欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素的峰面积,其峰面积的RSD分别为1.2%,2.5%,0.94%,表明仪器精密度良好。2.1.7样品稳定性试验分别于配制后的0,1,2,4,8,24h,精密吸取同一供试品溶液10μL进样测定峰面积,欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素稳定性的RSD分别为1.2%,2.9%,1.1%,表明处理后的样品在24h内稳定。2.1.8重复性实验结果取同一批药材粉末(40目)约1g,共6份,精密称定,按2.1.3项方法制备样品,测定欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素的平均含量分别为2.644,0.7733,2.669mg·g-1,RSD分别为1.4%,1.6%,1.9%,表明该方法重复性良好。2.1.9加样回收率试验取同一批已知含量的样品粉末约0.5g,精密称定,平行6份,分别精密加入一定量的混合对照品溶液,按2.1.3项下方法制备供试品溶液,测定并计算各成分的加样回收率及RSD,结果见表3。2.2重建因子的再现研究2.2.1相对校正因子的确定取2.1.2项下混合对照品溶液,进样2,5,10,15,20μL测定,按2.1.5项下计算欧前胡素对异欧前胡素、氧化前胡素的相对校正因子。实验考察了Agilent1200,ShimadzuLC-20A2种高效液相色谱系统,DikmaDiamonsilC18(4.6mm×250mm,5μm),DikmaPlatisilODS(4.6mm×250mm,5μm),PhenomenexLunaC18(4.6mm×250mm,5μm),PhenomenexGeminiC18(4.6mm×250mm,5μm),WatersRP18(4.6mm×250mm,5μm)5种色谱柱,相对校正因子的RSD<0.8%,说明相对校正因子在不同色谱柱和仪器下的耐用性较好,见表4。采用建立的“一测多评”试验方法在2个实验室进行试验,采用DikmaDiamonsilC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),结果见表5。不同实验室测得的相对校正因子相差不大RSD<0.6%,说明该方法耐用性较好。2.3组分色谱峰的定位通过保留时间差、相对保留值结合各组分的紫外吸收特征进行待测组分色谱峰的定位,结果见表6。由表6可知,各待测成分的相对保留值RSD≤5.0%,保留时间差则差异较大,通过相对保留值结合各色谱峰的紫外吸收特征,可正确判断出目标峰的准确峰位置。2.4外标和外标两种方法所需药材组分含量的对比精密吸取供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪,测定。采用“一测多评”法与外标一点法计算川白芷中欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素的含量,结果均以干燥品计,见表7。结果显示,2种方法所得的各批次药材的含量不存在显著性差异。由此说明“一测多评”法应用于川白芷的多成分质量评价是可行的。3检测波长的确定以甲醇为溶剂,比较超声、回流提取2种方法,结果超声提取效果更好。考察了甲醇、乙醚2种溶剂对川白芷中3种香豆素的提取效率的影响,乙醚更易于挥发对提取结果影响较大,故选择甲醇。以甲醇为溶剂,分别超声30,40,50min,结果40,50min均较30min提取完全,40,50min差异不大,故确定以甲醇超声提取40min,3种香豆素提取率较高,分离度较好,干扰的杂质峰较少,且方法简单,成本较低。对欧前胡素、氧化前胡素及异欧前胡素进行全波长扫描,其紫外吸收峰相似,均在250nm处有最大吸收,故选择250nm为检测波长。为了验证所建立的3种香豆素成分的一测多评法的适用性及可行性,进行了方法学考察,方法耐用性以及系统适应性试验。通过在Agilent和Shimadzu2台液相色谱仪,5根不同品牌及型号的色谱柱以及2个不同实验室的考察,结果表明欧前胡素与氧化前胡素、异欧前胡素之间的相对校正因子具有