野生软枣猕猴桃多糖抑菌作用研究

野生软枣猕猴桃多糖抑菌作用研究

野生软枣和桃的产于吉林省长白山区，每年8月至9月成熟。它是长白山地区著名的经济野果之一。他是珍贵的野生果实之王，被称为“世界上的珍宝”。据研究分析,野生软枣猕猴桃可以抑制易引起食品腐败的微生物生长,起到防腐保鲜的作用,同时它的多种保健作用,更能满足人们的健康要求,避免化学防腐剂给人们身体健康造成的危害。已有研究显示多糖具有抑菌作用,野生软枣猕猴桃果实中有丰富的多糖,目前国内对野生软枣猕猴桃果实的抑菌活性研究的报道近乎空白,有很广阔的开发潜力。本文旨在初探野生软枣猕猴桃多糖的抑菌活性,实验结果表明,其多糖对几种常见致病菌确实有明显的抑制作用,为进一步开发和利用野生软枣猕猴桃资源提供理论和实验依据。1材料和方法1.1供试菌株、仪器和测试材料野生软枣猕猴桃:辽宁省本溪市;野生软枣猕猴桃多糖:实验室自制。细菌:枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus);真菌:根霉(Rhizopus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、青霉(Penicilliumsp.)、热带假丝酵母(G.tropicalis)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae);由沈阳农业大学食品学院微生物实验室提供。供试培养基:细菌3种菌株采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(BPA),真菌6种菌株采用马铃薯培养基(PDA)。滤纸圆片为直径6mm、厚度1.5mm的定性滤纸。RE-52旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;5805高速冷冻离心机:INVESTMENT公司;DZF-6050真空干燥箱:上海沪粤明科学仪器有限公司;TU-1810紫外-可见分光光度计:深圳市凯铭杰仪器有限公司;HZP-150型全温振荡培养箱:上海精宏实验设备有限公司;BOXUN超净台:上海优浦科学仪器有限公司;HVE-50高压灭菌锅:HIRAYAMA公司;PB-10型pH计:Sartorius公司。1.2实验方法1.2.1野生软枣和桃的糖样品1.2.1.乙醇的蒸发、蒸发取冷藏的野生软枣猕猴桃,融化后打成匀浆后,采用料水比1:6(m/v)加水,在80℃恒温水浴锅中搅拌浸提5h。取出后纱布过滤、离心。将上清液旋转蒸发,浓缩至原体积的1/6,加入乙醇,使乙醇体积分数达到75%,静置6h。离心后将沉淀依次用丙酮、乙醚和乙醇洗涤脱脂,真空干燥得粗多糖。1.2.1.生软枣猕猴桃果实的制备将制得的粗多糖采用料水比1:3(以上述野生软枣猕猴桃果实计算)溶于水中,在pH8.0的条件下,加双氧水使体积分数达到50%,放入60℃的恒温水浴锅中加热5h。1.2.1.氯乙酸-正丁醇组的制备将脱色后的多糖溶液与1:8(m/v)的三氯乙酸-正丁醇等体积混合,振荡20min后静置1h,弃去上层有机层和中层蛋白层,保留下层多糖溶液。此步重复操作3次。1.2.1.4分析1.2.1.5.浓缩和干燥将多糖溶液旋转蒸发,浓缩到最小体积后,真空干燥,得到的则为野生软枣猕猴桃多糖样品。1.2.2野生软枣和桃子的糖菌实验1.2.2.添加c细菌培养基:牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15~20g,蒸馏水1000mL,pH7.2~7.4;霉菌及酵母菌培养基:马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15~20g,水1000mL。1.2.2.2.试验菌的激活和悬悬液的制备1.2.2.3.野生软枣和桃的溶解和稀释取制备好的野生软枣猕猴桃多糖,溶解稀释,得到5个浓度:100、50、25、10、5mg/mL。1.2.2.最小抑制浓度测定采用琼脂扩散滤纸片法测定抑菌圈直径,采用菌落直接观察法测定最小抑制浓度。方法见参考文献稍有改动,此文用的滤纸片直径为6mm,每个平皿贴7片。结果见表1和表2。1.2.2.不同ph值对软枣猕猴桃多糖抑菌活性的影响(1)不同温度对野生软枣猕猴桃多糖抑菌效果的影响。分别移取10mL质量浓度为100mg/mL的野生软枣猕猴桃多糖供试液于4个小烧杯中,放入直径为6mm的滤纸片(121℃条件下20min干热灭菌),在25、50、75、100℃水浴中加热浸泡1h。以枯草芽孢杆菌为代表菌,用琼脂扩散滤纸片法测定不同温度下的抑菌圈直径,重复该操作3次,结果见表3。(2)不同pH值对野生软枣猕猴桃多糖抑菌活性的影响。取7个小烧杯,分别移取10mL质量浓度为100mg/mL的野生软枣猕猴桃多糖供试液,用0.1mol/L的HCl和0.1mol/L的NaOH配制成pH值为3、4、5、6、7、8、9的不同溶液。放入上述处理过的滤纸片,浸泡30min。以枯草芽孢杆菌及米曲霉为代表菌,比较不同pH值对野生软枣猕猴桃多糖抑菌活性的影响,重复操作3次,结果见表4。2野生软枣猕猴桃多糖对酵母的最小抑制作用由表1、表2可知,野生软枣猕猴桃多糖对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、根霉、黑曲霉、米曲霉、青霉、啤酒酵母均有一定的抑制效果,且作用相当;随着多糖质量浓度的增大,抑制作用增强;最小抑制浓度(MIC)在10~25mg/mL之间。野生软枣猕猴桃多糖对细菌和霉菌有较好的抑制效果,对啤酒酵母也有较好的抑制效果,而对热带假丝酵母没有抑制作用,这说明野生软枣猕猴桃多糖对酵母的抑制有选择性。由表3可知,以生理盐水为空白对照液,温度越高,抑菌圈直径越大,即野生软枣猕猴桃多糖的抑菌效果越明显,因为温度升高,野生软枣猕猴桃多糖溶液有浓缩的趋势。由表4可知,以生理盐水为空白对照液,pH值对野生软枣猕猴桃多糖的抑菌效果有明显的影响,偏酸性的pH值更有利于抑菌,在pH4~5范围内,抑菌效果较好。3野生软枣猕猴桃多糖的抑菌效果野生软枣猕猴桃多糖具有较强的抑菌作用。对常见细菌和霉菌都有较好的抑菌效果,对酵母的抑制作用具有选择性,对供试的热带假丝酵母没有抑制效果。对同一个菌种而言,抑制效果随多糖浓度的增大而显著提高。野生软枣猕猴桃多糖对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、根霉、黑曲霉、米曲霉、青霉、啤酒酵母最小抑制浓度在10~25mg/mL之间。温度和pH值对野生软枣猕猴桃多糖的抑菌效果也有一定影响。实验表明,温度越高,野生软枣猕猴桃多糖的抑菌效果越明显,