一测多评法在淫羊藿中的方法学考察

一测多评法在淫羊藿中的方法学考察

绵羊：男性植物小科祥、箭叶关键词：sagistatum、柔软的头发、菖蒲、山西人、流行性感冒、日本电视台的干燥区域。其具有补肾阳,强筋骨,祛风湿。用于阳痿遗精,筋骨痿软,风湿痹痛,麻木拘挛;更年期高血压。目前已有同时测定淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷这4个指标成分含量的报道,但这些方法难以在实际工作中广泛应用,其主要原因是由于一些对照品(如朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C)价格昂贵且难以获得,这直接限制了用常规的外标法或内标法实现其多指标质量控制的设想。在对成分复杂的中药进行质量评价的过程中,由于中药成分之间具有相互协同作用的特点以及先进分析技术的广泛应用,选择单一成分进行质量评价的传统方法已经逐渐被同时测定多种有效成分的方法所取代,“一测多评”的研究思路已经在木通、人参、黄芪、栀子等药材中得到验证,本文将一测多评法应用于淫羊藿药材的质量控制,实现其多成分的同步测定。1仪器与试药JASCOPU-980高效液相色谱仪(JASCO日本分光公司),JASCOUV-925紫外-可见光检测器,ANASTAR色谱工作站;Shimadzu高效液相色谱仪(日本岛津公司),SPD-10Avp紫外检测器,ANASTAR色谱工作站;KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。12批淫羊藿药材分别购自青海、新疆、吉林、四川等地。样品经沈阳药科大学中药学院孙启时教授鉴定,购自上海和湖南的药材为柔毛淫羊藿E.pubescens,购自湖北的药材为巫山淫羊藿E.wushanense,其余均为朝鲜淫羊藿E.koreanum。朝藿定A(批号A0228)、朝藿定B(批号A0229)、朝藿定C(批号A0230)对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司,HPLC(峰面积归一化法)纯度≥98%,淫羊藿苷(批号110737-200312)购自中国药品生物制品检定所。乙腈(批号100108),色谱纯,天津市康科德科技有限公司,水为实验室自制重蒸水,其余试剂均为分析纯。2方法与结果2.1方法原理一测多评法(Quantitativeanalysismulti-componentsbysinglemarker,QAMS)是指在多指标质量评价时,以药材中某一典型组分(有对照品供应者)为内标,建立该组分与其他组分之间的相对校正因子,通过校正因子计算其他组分的含量。fkm=fk/fm=Wk×Am/Wm×AkAk为内标物峰面积,Wk为内标物浓度,Am为其他组分m峰面积;Wm为其他组分m浓度。2.2一测多评方法学考察2.2.1色谱条件DiamonsilC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相乙腈-水(25∶75),柱温30℃;流速1.0mL·min-1,检测波长为270nm,见图1。2.2.2对照品溶液的制备取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷对照品适量,精密称定,加甲醇配置成浓度分别为66.7,102,40.8,188mg·L-1的储备液。另取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷对照品适量,精密称定,用甲醇溶解,配置成0.115,0.299,0.328,0.250g·L-1的混和标准溶液,保存于4℃冰箱中,备用。2.2.3供试品溶液的制备取淫羊藿药材粉末(过60目筛)1g,精密称定,至于100mL具塞锥形瓶中,精密量取20mL50%乙醇加入,称重,超声20min(140W,频率40kHz),再称重,以50%乙醇补足重量,离心(13000r·min-1,10min),经0.45μm微孔滤膜过滤,10μL进样。2.2.4线性关系考察分别精密量取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷混合标准溶液1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0mL,置10mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。分别精密吸取上述混合对照品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪,按上述色谱条件测定,记录峰面积。以进样量对峰面积积分值进行回归处理,得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的标准曲线,见表1,各标准曲线在线性范围内线性良好。2.2.5校正因子的计算在上述色谱条件下,分别测定不同进样体积时,以淫羊藿苷(Icarrin,简称i)为内标,朝藿定A(epimedinA,简称A)、朝藿定B(epimedinB,简称B)、朝藿定C(epimedinC,简称C)的相对校正因子f,见表2。2.2.6精密度试验精密吸取同一供试品溶液10μL连续进样6次,记录朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的峰面积,得出日内精密度分别为2.1%,2.2%,2.3%和1.2%;连续进样3d,每天6次,记录峰面积,以上4种指标成分日间精密度分别为2.4%,1.2%,2.2%,1.4%。2.2.7供试品溶液稳定性试验取同一供试品溶液(吉林),分别于0,2,4,8,12,24h,注入高效液相色谱仪,依法测定,记录峰面积,得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷稳定性的RSD分别为2.2%,1.2%,2.6%,1.3%。表明处理后的样品在1d内稳定。2.2.8重复性试验按上述供试品溶液制备方法,称取同一批淫羊藿药材粉末(吉林)约1g,共6份,分别进行测定,测得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的平均含量分别为0.467,0.797,0.467,1.691μg·g-1,RSD分别为2.1%,2.1%,2.2%,1.1%。2.2.9回收率试验采取加样回收率法(按1∶1加入),取同一批已知含量的淫羊藿药材粉末(吉林)约0.5g,6份,精密称定,分别精密加入一定量的2.2.2项下朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷对照品溶液,按2.2.3项下方法制备供试品溶液,精密吸取上述供试品溶液10μL,依法测定,计算回收率,朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的加样回收率分别为97.6%,99.5%,100.1%,97.4%,RSD分别为2.8%,1.8%,2.2%,2.1%。2.3校正因子的重现性考察2.3.1色谱柱及高效液相色谱仪考察精密吸取2.2.2项下混合对照品溶液1,2,4,6,8,10μL,进样分析,按2.1项下方法计算试验考察了Shimadazu,JASCO两种高效液相色谱系统和DiamonsilC18(4μm×250mm,5μm),EliteHypersilDBS(4μm×250mm,5μm),PhemomenexGeminiC18(4μm×250mm,5μm)3种色谱柱,见表3。2.3.2待测组分色谱峰的定位在只使用一个对照品时,如何正确指认药材中其他3个待测成分是一个必须解决的问题。本文采用相对保留值α(待测成分与内标调整保留时间之比)作为定位标准,并在不同品牌高效液相色谱系统和不同色谱柱下对此参数进行考察,见表4,各成分的相对保留值α波动较小,RSD≤5%,表明利用α值进行峰的定位是可行的。2.4淫羊藿药材含量测定一测多评法与常规法的结果比较分别称取淫羊藿药材粉末(过60目筛)约1.0g(n=3),精密称定,按2.2.3项下方法制备各供试品溶液,精密吸取各供试品溶液10μL,注入高效液相色谱仪,依法测定。采用外标法和一测多评法计算不同产地及不同种类的淫羊藿药材中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量,见表5。常规的外标法实测含量值与一测多评计算的含量值经t检验比较,P>0.05,表明2种方法测得结果没有显著性差异。由此说明一测多评法可用于淫羊藿药材的多成分质量评价研究。3讨论在查阅文献、借鉴前人研究结果的基础上,本试验分别考察了20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%乙醇8种提取溶剂,超声、回流不同提取方法,发现采用20mL50%乙醇超声20min提取,能够兼顾上述4种黄酮类成分,得到满意的提取率,且方法简单,故选用50%乙醇超声20min作为本试验的提取条件。本实验选用淫羊藿苷作为内标进行QAMS(一测多评法)是由于淫羊藿苷为淫羊藿中主要有效成分,且该对照品价廉易得。针对只使用单个对照品如何正确定位淫羊藿药材中其余3个目标色谱峰的问题,本文引入了相对保留值α这种参数作为定位标准,并考察了3根不同品牌的色谱柱和两种高效液相色谱系统,比较结果显示,采用相对保留值更能够准确定位上述目标色谱峰。朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷是淫羊