一测多评hplc法测定丹参注射液中原儿茶醛

一测多评hplc法测定丹参注射液中原儿茶醛

丹参注射液是我国的基本药物品种。被列入《中华人民共和国卫生部药物标准中药方剂》第20卷。这是在水提取物和丹参酸乙醇沉积法形成的独特中药注射剂。具有活血化瘀、通脉养心的功能。临床上主要用于冠心病所致胸闷、心绞痛等症的治疗,近年来也广泛应用于心脑血管疾病、肝病、肾病、急性肺损伤、胰腺炎等病的治疗[1~4]。药理研究表明,水溶性酚酸类成分是丹参注射液发挥活血化瘀功效的主要成分。按照传统中医药学的“整体观”,中药药效是药品中多个药效成分的综合效应,近年来关于同时测定丹参药材或制剂中多种水溶性成分含量的报道虽不鲜见,但基本都是采用外标法测定含量[7~11],现行标准也采用高效液相色谱法,以外标法测定4种成分(丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B)的含量。由于标准物质昂贵而不易获得,应用外标法每多测定1种成分都将使检验成本大幅提高,从而限制了这些方法在药品质量控制中的应用。一测多评技术(quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-marker,QAMS)是当前解决这一矛盾的重要途径之一。本文结合2011年国家药品评价性抽验工作,建立了仅以原儿茶醛(protocatechuicaldehyde)为对照,同时测定丹参注射液中丹参素钠(sodiumdanshensu)、原儿茶酸(protocatechuicacid)、原儿茶醛(protocatechuicaldehyde)、香草酸(vanillaacid)、阿魏酸(ferulicacid)、迷迭香酸(rosmarinicacid)、丹酚酸B(salvianolicacidB)共7个水溶性成分的一测多评方法,并考察了该方法的适用性和可行性,方法简便,结果准确,可在节约多成分含量测定检验成本的同时较全面地控制该品种内在质量。1药物对照品及药品测定岛津LC-20A高效液相色谱仪,岛津UV-20A紫外检测器,WatersSymmetryC18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,SartoriusR200D分析天平。乙腈、甲醇(色谱纯,山东禹王实业有限公司化工分公司),三氟乙酸(分析纯,上海中秦化学试剂有限公司),蒸馏水(杭州娃哈哈集团有限公司)。对照品丹参素钠(批号:110855-200809)、原儿茶酸(批号:110809-200604)、原儿茶醛(批号:110800-200506)、阿魏酸(批号:110773-200611)、香草酸(批号:10776-200402)、迷迭香酸(批号:111562-201001)、丹酚酸B(批号:111562-201001),均购自中国食品药品检定研究院,供含量测定用。丹参注射液为2011年度国家药品评价性抽验样品,来自5个生产企业,共18个批次。2方法和结果2.1.1混合对照溶液2.2条件12.3方法学的检验2.3.1线性域2.3.2精密度测试2.3.3重复试验2.3.4稳定性试验2.4参比及色谱结果重现性分析2.4.1待测指标相对校正因子计算式中,As、Cs分别为内参物对照品的峰面积和浓度;Ai、Ci分别为待测成分对照品的峰面积和浓度。依次精密量取“2.1.1”项下混合对照品储备液5,10,20μL及混合对照品溶液1,5,10μL分别进样,测定各成分色谱峰峰面积。以原儿茶醛为内参物,计算丹参素钠、原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B相对于原儿茶醛的f,求得各成分6次测定所得f的平均值分别为8.959,2.573,2.634,1.165,2.269,4.986;RSD分别为0.25%,0.03%,0.05%,0.20%,0.08%,0.06%。2.4.2一测多评法待测色谱峰的定位一测多评法色谱峰一般可采用保留时间差(各待测成分与内参物保留时间的差值)或相对保留值(各待测成分与内参物保留时间的比值)等参数结合色谱图整体特征,以及每个峰的紫外吸收特征来准确定位。本研究测定了相对保留值、保留时间差在不同品牌仪器、不同型号色谱柱上的重现性。结果表明,相对保留值的波动较明显(RSD>5%),不宜作为色谱峰定位依据;保留时间差的波动相对较小,以保留时间差定位结果见表3。2.4.3一测多评法与外标法测定结果的比较3讨论3.1色度条件的选择3.2内部产品的选择3.3挥发油a、c、lods-sp,a在不同实验室,采用WatersSymmetryC18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,分别考察了2种不同的高效液相色谱系统(A系统:岛津LC-20A高效液相色谱仪,UV-20A紫外检测器;B系统:WatersAlliancee2695高效液相色谱仪,Waters2998二极管阵列检测器)对6个成分相对于原儿茶醛的f的影响。结果丹参素钠、原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B在A系统上的f分别为8.96,2.57,2.63,1.17,2.27,4.99;在B系统上的相对校正因子分别为8.94,2.53,2.67,1.21,2.23,4.96。采用2种系统求得各成分相对校正因子的相对平均偏差≤5.0%。在同一高效液相色谱仪(岛津LC-20A)上,考察不同色谱柱[A柱:WatersSymmetryC18(4.6mm×250mm,5μm);B柱:InertsilODS-SP(4.6mm×250mm,5μm);C柱:CAPCELLPAKC18(4.6mm×250mm,5μm)]对丹参注射液中6个水溶性成分f的影响。结果丹参素钠、原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B在A柱上的f分别为8.96,2.57,2.63,1.17,2.27,4.99;在B柱上的f分别为8.89,2.48,2.51,1.12,2.34,5.05;在C柱上的f分别为8.92,2.37,2.56,1.15,2.25,5.01。3种色谱柱求得各成分f的RSD≤5.0%。3.4结论2.1回收率与精密度精密称取丹参素钠、原儿茶酸、原儿茶醛、阿魏酸、香草酸、迷迭香酸、丹酚酸B的对照品适量,加70%甲醇溶液制成每1mL分别含丹参素钠0.605mg、原儿茶酸0.154mg、原儿茶醛0.116mg、阿魏酸0.512mg、香草酸0.112mg、迷迭香酸1.104mg、丹酚酸B1.071mg的溶液作为混合对照品储备液。精密量取上述混合对照品储备液1.0mL,置于10mL棕色量瓶中,加70%甲醇溶液稀释至刻度,即得混合对照品溶液。取丹参注射液样品,用微孔滤膜(0.22μm)滤过,即得采用WatersSymmetryC18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,以乙腈(A)-0.05%三氟乙酸(B)为流动相,梯度洗脱(0~7min,2%A→10%A;7~20min,10%A→23%A;20~35min,23%A→27%A;35~45min,27%A→49%A),流速0.8mL·min-1,检测波长288nm,柱温25℃。在上述色谱条件下,取混合对照品溶液及供试品溶液各进样5μL,色谱图见图1。精密吸取“2.1.1”项下混合对照品储备液5,10,20,50,60μL及混合对照品溶液1,5,10μL,注入液相色谱仪,以色谱峰峰面积(X)为横坐标,进样量(Y,μg)为纵坐标绘制标准曲线,各成分回归方程、线性范围见表1。精密吸取混合对照品储备液10μL,按“2.2”项下色谱条件连续进样6次,测得丹参素钠、原儿茶酸、原儿茶醛、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B峰面积的RSD分别为0.14%,0.27%,0.27%,0.25%,0.45%,0.33%,0.23%。结果表明该方法的精密度较好。取同一样品(批号100206)的供试品溶液5μL共6份,按“2.2”项下色谱条件测定。测得丹参素钠、原儿茶酸、原儿茶醛、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B平均含量分别为5.755,0.013,0.498,0.035,0.066,0.281,1.260mg·mL-1;RSD分别为0.54%,2.04%,0.36%,1.25%,1.07%,0.85%,0.74%。结果表明该方法的重复性较好。取批号为100206的样品制备供试品溶液,按“2.2”项下色谱条件分别在0,4,8,12,18,24h进样5μL进行测定。测得24h内丹参素钠、原儿茶酸、原儿茶醛、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B峰面积的RSD分别为0.74%,0.85%,0.25%,0.32%,1.12%,0.31%,0.74%,表明供试品溶液在24h内稳定。精密吸取已知含量的样品(批号100206)6份,每份1mL,分别置于5mL棕色量瓶中,精密加入每1mL含有丹参素钠6.12mg、原儿茶酸0.02mg、原儿茶醛0.61mg、香草酸0.02mg、阿魏酸0.05mg、迷迭香酸0.25mg、丹酚酸B1.05mg的混合对照品溶液1mL,用蒸馏水稀释到刻度。按“2.2”项下色谱条件进样5μL进行测定,计算回收率,结果见表2。7个待测成分加样回收率在95%~105%以内,说明该方法准确度较好。2.3.5测定化合物的稳定性相对校正因子(relativecorrectionfactor,f)计算公式为:丹参注射液样品按“2.1.2”项下方法处理,采用“2.2”项下色谱条件进样5μL进行测定,用外标法对7个待测成分定量测定,与一测多评法测定结果比较,验证一测多评法用于丹参注射液中7个酚酸类成分测定的准确性。结果表明,本文所建立的一测多评法以原儿茶醛为内参物,测定丹参素钠、原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B的结果与外标法测定结果无显著差异(相对偏差≤5.22%)。比较结果见表4与表5。丹参注射液中含有大量的酚酸类化合物,且极性范围跨度较大,故采用梯度洗脱;化合物均含有若干个酚羟基,呈弱酸性,故采用酸性缓冲系统。采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察,结果酚酸类化合物在288nm处均呈现良好的紫外吸收,色谱信息最为丰富,故选用288nm作为检测波长。试以丹参素钠为内参物,各成分外标法与一测多评法定量结果差异显著,相对偏差7.88%~33.45%,因此未选用丹参素钠为内参物。当以原儿茶醛为内参物时,各