基因（基因工程课件）

基因概述CONTENTS目录01基因学说的创立02基因与DNA分子的关系03基因的概念04基因的特点05基因的分类06基因的结构基因学说的创立遗传因子（hereditaryfactor）概念孟德尔提出1857年到1864年，豌豆杂交试验。双因子杂交试验子一代种子全是黄色圆形自交黄色圆形：黄色皱形：绿色圆形：绿色皱形9：3：3：1黄圆种子绿皱种子子一代种子全是圆形自交圆皱比3：1圆形种子皱形种子推想：每一性状都由遗传因子控制，这些因子从亲代到子代，代代相传；体细胞中：遗传因子成对存在，一个来自父本，一个来自母本；配子中：成对的遗传因子彼此分开，成单存在；杂交子一代体细胞中：成对的遗传因子各自独立存在。在形成配子时，彼此分离；令人遗憾的是，孟德尔的这些科学发现和见解湮没了35年。1900年，荷兰H.DeVries、德国C.Correns和奥地利E.Tschermak等植物学家，各自独立地做了与孟德尔相似的实验，得出了与孟德尔相似的结论。1909年，丹麦生物学家W.Johannsen根据希腊文“给予生命”之义，创造了（gene)一词，并用这个术语来代替孟德尔的“遗传因子”。美国著名的遗传学家摩尔根（T.H.Morgan）对基因学说的建立做出了卓越的贡献。1910年，摩尔根和他的助手，从红眼的果蝇群体中发现了一只白眼的雄果蝇。正常果蝇都是红眼（）野生型），白眼果蝇为突变型。1915年子一代全部红眼果蝇自交有红眼、有白眼所有白眼果蝇都是雄性白眼雄果蝇解释：果蝇有4对染色体雌果蝇：1对很小呈粒状，2对呈V形，1对呈棒状的特征为XX染色体；雄果蝇：前3对同雌果蝇的完全一样，但没有1对棒状的XX染色体，它是由1个棒状的X染色体和一个J形的Y染色体取代，这一对叫做XY染色体。红眼雌果蝇摩尔根推测：白眼：隐性性状的基因（W）是位于X染色体上，而在Y染色体上没有其等位基因。实验：子一代红眼雌果蝇（Ww），跟亲本白眼雄果蝇（wY）回交，后代1/4是红眼雌果蝇，1/4是白眼雄果蝇。证实：白眼隐性突变基因（w）确实位于X染色体上，这种现象为遗传性状的连锁定律。基因学说得到了普遍地承认但是，基因的结构特征是怎样的？基因怎样进行复制的？基因与DNA分子的关系实验证明基因的化学本质是DNA分子美国著名的微生物学家O.T.Avery和他的合作者C.M.Mleod及M.McCarty将S型（光滑、有毒）肺炎链球菌的DNA加到R型（粗糙、无毒）肺炎链球菌的培养物中，使R型转变成S型，表现出具有毒力的荚膜的特性。说明，使细菌性状发生变化的是DNA而不是蛋白质或RNA分子。1952年，肯定了Avery的结论。美国冷泉港卡内基遗传学实验室A.D.Hershey和他的学生M.Chase。用放射性同位素32P和35S,分别标记T2噬菌体DNA和外壳蛋白质。双标记的噬菌体感染大肠杆菌。结果：只有32P标记的DNA注入到寄主细胞内，并且重新繁殖出子代噬菌体。实验进一步表明：在噬菌体中的遗传物质也是DNA分子，而不是蛋白质。证明了DNA是遗传物质和基因的载体研究表明：在生物界并非所有的基因都是由DNA构成的。某些动物病毒和植物病毒以及某些噬菌体。遗传物质是RNA而不是DNA。基因的概念控制性状的基本遗传单位。排列在染色体上，携带特定遗传信息；具有一定结构；自我复制与信息传递的一段DNA或RNA序列。基因的概念控制性状的基本遗传单位。排列在染色体上，携带特定遗传信息；具有一定结构；自我复制与信息传递的一段DNA或RNA序列。基因的概念控制性状的基本遗传单位。排列在染色体上，携带特定遗传信息；具有一定结构；自我复制与信息传递的一段DNA或RNA序列。基因的特点基因决定性状自我复制：半保留复制基因有相对的稳定性基因会发生突变基因的分类按照重要程度分类看家基因：维持细胞基本功能的基因；必需基因：突变致死基因；按物种分类原核基因真核基因病毒基因按基因拷贝数分类单拷贝基因多拷贝基因按照功能分：结构基因：能够翻译的基因调控基因：调节结构基因表达调节基因、操纵基因、启动基因只转录不翻译的基因：rRNA基因、tTNA基因；基因的结构真核生物基因结构5’-UTR结构基因3’-UTR增强子转录起始位点启动子外显子终止子内含子Poly-A结构基因：不连续，内含子与外显子交替排列。并非所有结构基因都包含内含子。外显子（exon)：结构基因中的编码序列，在成熟mRNA中保留的片段。内含子（intron)：结构基因中的非编码序列，在mRNA成熟过程中被切除的部分。启动子（promoter):位于转录起始位点上游的一段DNA序列,是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的位点。增强子：启动子上游或下游的一段序列，增强启动子转录，提高转录效率。终止子：阻碍RNA聚合酶移动，终止RNA转录的DNA序列。UTR:非翻译区。基因的结构原核生物基因结构调节基因半乳糖苷酶基因调节基因启动子渗透酶基因转乙酰酶基因结构基因启动子阻遏蛋白结合位点原核生物基因的功能单位：操纵子，含有一个启动子核多个结构基因。大肠杆菌乳糖操纵子由3个结构基因和一个操纵基因组成：调节基因lacI的表达产物（阻遏物（repressor)），与操纵基因结合，阻遏结构基因lacZ、lacY和lacA表达。β-半乳糖苷酶（β-galactosidase)、透性酶（permease)和乙酰基转移酶（acetylase)的合成也就停止下来。当细胞中代谢产物乳糖（lactose)累积增多，与阻遏物结合，使阻遏物与操纵基因脱离，结构基因恢复转录，合成出参与乳糖代谢的3种酶蛋白。乳糖起到一种诱导物（inducer)的作用。基因的结构病毒基因功能相关的基因排列在一起。基因结构不规则。有重叠基因。两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。PCR扩增技术CONTENTS目录01PCR扩增技术发明02PCR扩增技术原理03PCR反应五要素04DNA聚合酶05PCR的类型PCR扩增技术发明PCR（PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。由1985年穆里斯（K.Mullis）发明，因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。

PCR法克隆目的基因前提：已知待扩增目的基因两侧序列，根据该序列合成反应必需的双引物。PCR扩增技术原理包括三个步骤：

=>DNA模板变性(95℃)=>与DNA引物退火(45℃-55℃)=>引物延伸(72℃)30-35个循环变性退火延伸延伸PCR扩增技术的基本原理PCR反应五要素

模板：按照模板的序列合成新链。引物：结合在模板的3’端，在引文的3’端开始合成新链。dNTP：PCR合成原料。缓冲溶液：提供反应的液体环境。DNA聚合酶：合成新链。DNA聚合酶DNA聚合酶的种类依赖于DNA的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ(全酶)DNA聚合酶Ⅰ大片段(klenow片段)耐热DNA聚合酶(Taq

酶)依赖于RNA的DNA聚合酶:反转录酶不依赖于DNA的DNA聚合酶:末端转移酶E.coliDNA聚合酶I（pol

I）

1.E.coli的DNA聚合酶系统PolI

polII

polIII

2.E.colipolI

在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段小片段具5’→3’外切酶活性大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段,pol

IK)DNaseI1.特点：具内切酶活性，无序列特异型；作用于ds-DNA，产生5’-P低聚核苷酸;当酶浓度很低时，ds-DNA分子上形成切口。

2.用途

1)制备DNA探针

2)制备RNA样品时,除去DNA分子

3)基因突变时产生切口大肠杆菌DNA聚合酶I基本用途5’→3’外切5’→3’聚合制备32P标记的探针DNA聚合酶I5’G-C-A-T-C-A-T-G-G-C-T-A-C-T-T-G-G-A-C3’3’C-G-T-A-G-T-A-C-C-G-A-T-G-A-A-C-C-T-G5’5’G-C-A-T-CA-T-G-G-C-TA-C-T-T-G-G-A-C3’3’C-G-T-A-G-T-A-C-C-G-A-T-G-A-A-C-C-T-G5’DNA聚合酶I4种dNTPppp32dA5’G-C-A-T-C-A-T-G-G-C-T-A-C-T-T-G-G-A-C3’3’C-G-T-A-G-T-A-C-C-G-A-T-G-A-A-C-C-T-G5’双链DNA（基因）分子用一条单链作为模板信使RNA分子，以其为模板互补的单链DNA，以其为模板组成一个双链cDNA分子cDNA短，比基因少了内含子依赖于RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）转录并成熟合成cDNA依赖于RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）双向外切DNA/RNA杂合链中的RNA链RNADNA逆转录酶逆转录酶TaqDNA聚合酶1）来自水生栖热菌Thermusaquaticus；2）良好的耐热性；3）Mg2+依赖性；4）无校正功能。特点：最适反应温度75℃对95℃高温具良好稳定性不存在3’→5’外切酶活性用途：PCRPCR的类型多重PCR定量PCR差异显示PCR锚定PCRRT-PCR-----多重PCR: