全细胞膜片钳技术对小鼠鼻型过敏反应的初步研究

全细胞膜片钳技术对小鼠鼻型过敏反应的初步研究

鼻子内粘膜的感知神经（或n）是感知传导路径中的第一个神经元。或n具有特殊的电生化学特性。细胞细胞有不同的离子通道，在接收和传播听觉信息方面发挥着重要作用。对ORN的电生理学特性的研究,有利于弄清嗅觉产生和调节的机制,并为嗅觉障碍的研究和治疗奠定基础。自1976年膜片钳技术诞生以来,利用膜片钳技术进行电生理学的研究已成为一种重要的研究手段。本研究应用全细胞膜片钳技术对小鼠急性分离的ORN的电生理学特性进行了初步研究和探讨。1材料和方法1.1酶活剂Ringers液(mmol/L):NaCl140,KCl5,CaCl21,MgCl21,葡萄糖10,HEPES10,丙酮酸钠1。pH7.2,用1mmol/L的NaOH调节。电极内液(mmol/L):KCl145(CsCl145,用于阻断钾电流),HEPES10,ATP1,MgCl24,EGTA0.5,GTP0.5。pH7.4,用1mmol/L的KOH或CsCl调节。酶液配制:用无Ca2+、Mg2+Ringers液稀释胰蛋白酶,浓度为1mg/mL,放于-20℃冰箱备用,每次用前解冻。终止用细胞培养液:90%达而伯克改良的伊格尔培养基(DMEM),10%胎牛血清,pH7.3～7.4。1.2全细胞膜片钳的制备选用生后7～14d的昆明小鼠(由四川大学实验动物中心提供),雌雄不限。将小鼠断头处死,剪开双侧鼻腔外侧壁,并于解剖显微镜下取出嗅区黏膜置于Ringers液中清洗2～3次,将黏膜组织剪成1～2mm大小的组织块。清洗后的嗅黏膜置于含0.1%胰蛋白酶的离心管中,室温(20～24℃)下孵育消化8～15min,消化完毕后,吸出酶液,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化,巴氏管轻柔吹打,吸出细胞悬浮液置于培养皿中的盖玻片上。静止贴壁30～45min后,用Ringers液小心更换盖玻片上的液体,在倒置相差显微镜(Olympus,Japan)下选择胞膜光滑、胞体折光性好、活性良好的ORN进行全细胞膜片钳记录。膜片钳记录时,玻璃管微电极内加入电极内液,细胞置于Ringers液中。对于不同年龄的小鼠,在消化过程中可以适当调整酶浓度或酶解时间,以获取更多活性良好的ORN。1.3全细胞记录模式采用两步法拉制玻璃微电极(硅硼玻璃,薄壁),电极尖端0.5～2μm,阻抗为2.8～4MΩ。在微操纵仪的推动下,将玻璃微电极尖端接触ORN细胞膜,并应用负压抽吸使电极尖端和细胞膜形成高阻封接,封接电阻达到1GΩ以上,使膜片与周围环境形成电化学隔离。予以快电容补偿(C-fast)。待高阻封接形成稳定后,应用负压抽吸,使吸附于电极尖端的一小片细胞膜破裂,即“破膜”。此时电极内液与细胞外液相通,形成了全细胞记录模式。补偿慢电容(C-slow)及串联电阻(R-series)后,从微电极处引出的全细胞电流通过膜片钳放大器(Axopatch200B,AxonInstruments,USA)输入计算机,应用pClampex8.1专用软件进行采样分析。通过设定不同的实验程序,可以记录到不同钳制电压下通道电流的幅度、激活和失活电流的峰值和时程以及膜电容、串联电阻、输入电阻及电容时间常数等生理特征和参数。以上实验均在室温条件(22～25℃)下进行。在全细胞电压钳记录模式下,设定一定的刺激程序,记录细胞的膜电容,并利用膜片钳专用记录软件动态记录细胞膜电容的波动趋势。最后,用电流值除以膜电容得到电流密度。2结果2.1神经突变也完整的活性良好的ORN细胞胞体呈圆形或椭圆形,直径5～8μm,可见明显的神经突起,并在部分细胞的突起末端可见圆形小结,称为嗅泡(olfactoryknob),胞膜光滑,胞体折光性好,胞内未见布朗运动(图1)。本实验方法分离的ORN在室温下5h内可以满足膜片钳实验要求。2.2膜片记录器在全细胞模式下,应用不同的刺激程序,在ORN的胞体上成功记录到电压依赖性钠、钾电流。2.2.1外向电流的特性全细胞电压钳模式下,膜电位钳制在-60mV,给予-70～+70mV的阶梯去极化脉冲刺激,阶跃5mV,刺激波宽100ms,刺激频率0.25Hz,记录不同电压条件下细胞离子通道电流的变化情况。以上的刺激程序可以激发快速激活、快速失活的内向电流和持续的外向电流(图2),位于基线上方者为外向电流,反之为内向电流。在ORN胞体上成功记录到电压依赖性的内、外向混合电流。I-V曲线(图3A)显示内向电流在-60～-50mV左右激活,-20～-30mV左右达最大值,+20mV翻转。不同的刺激电压,内向电流亦呈非线性变化,表明内向电流有电压依赖性。在细胞外液中加入河豚毒(TTX)0.1μmol/L,内向电流被完全阻断,说明内向电流主要由Na+介导。将钠电流的I-V曲线通过Boltzman方程G=Gmax/{1+exp[(V-Vmid)/Vc]}进行拟和(式中G为膜电导,Gmax为最大膜电导,Vmid为半数最大激活电位,Vc为曲线的斜率因子),可以得到钠电流的激活曲线(图3B),拟和结果显示该电流的Vmid=(-34.8±0.8)mV,Vc=2.4±0.5。2.2.2延迟特性ia小鼠ORN的外向电流包括瞬时成分和延迟成分,I-V曲线(图4)显示,外向电流在-40mV左右激活,+70mV达到最大值。随时间的推移和膜电压的增加,外向电流呈非线性增加,表明外向电流有电压依赖性。本实验记录到的小鼠ORN的外向电流主要由瞬时K+电流(IA)和延迟整流K+电流(Ik)组成。IA具有快速激活、快速失活的特性,钳制电位高于-40mV时,该电流失活。将细胞钳制于-100mV,给予-80～+60mV刺激,时程300ms,阶跃20mV,可以得到包括瞬时和持续成分的外向电流(图5A)。同一细胞钳制在-40mV,给予-20～+70mV刺激,时程400ms,阶跃10mV,外向电流的瞬时成分消失,仅有持续成分存在(图5B)。延迟钾电流具有激活缓慢、延迟失活的特性,其I-V曲线显示ORN的延迟钾电流与电压的关系为非线性的,属于延迟整流范畴。在电极内液中用145mmol/LCsCl取代145mmol/LKCl,外向电流可以完全阻断,由此证明了外向电流为钾电流。电流密度曲线(图6)显示虽然不同ORN的大小不同,离子通道数目不同,但是电流密度差异不大。在某一固定的电压下,每一个细胞的最大电流密度总是围绕某一固定值波动。3小鼠嗅感悟神经系统离子通道的研究急性分离的细胞保持与体内细胞相同的基本结构和功能,仍具有全套二倍体基因,接近于生理状态。在理论上,酶能不可逆地破坏生物膜上的蛋白质,而离子通道本身就是蛋白质,因此,利用酶消化结合机械分离的嗅感觉神经细胞亦存在这样的问题。本研究结果显示,在一定的实验条件下,胰蛋白酶不会破坏细胞主要的Na+、K+通道,急性分离的嗅感觉神经细胞能较好保存主要通道的活性。作为嗅觉传导途径的初级神经元,嗅感觉神经细胞具有接受外周嗅觉冲动并将嗅觉信号向中枢传导的作用。利用全细胞膜片钳技术对其离子通道进行记录和分析,可以了解该细胞膜上离子通道的活性及离子通道阻滞剂和药物对通道活动的影响。本研究采用全细胞电压钳技术对嗅感觉神经细胞胞膜上的离子通道进行了记录和研究,初步了解到急性酶分离的小鼠嗅感觉神经细胞胞膜上存在有对TTX敏感的钠通道及包含有瞬时成分和持续成分并能被CsCl完全阻断的钾通道。钠电流是神经细胞兴奋性的标志,它的激活产生动作电位的上升相,即使细胞极化。而钾电流种类较多,不同的细胞可具有不同的钾电流类型,在动作电位的不同时相起不同的作用。电压依赖性钾通道在调节神经元兴奋性等生理功能中起重要作用,参与神经细胞膜复极化,与动作电位阈值及其产生、时程和发放频率有密切关系,也可影响钙内流,调节神经递质的释放。而小鼠嗅感觉神经细胞的瞬时钾通道(IA)可以被4-氨基吡啶(4-AP,5mmol/L)及垂体腺苷酸环化酶促多肽(PACAP,40nmol/L)阻断,该电流可以被不同的嗅觉信号分子调节,并在细胞兴奋性方面起重要作用。在嗅感觉神经细胞的胞体上还可以记录到L型和T型的钙电流,该电流亦参与形成动作电位的上升相,在细胞的极化过程中起一定的作用,但在本研究中并未记录到该电流,原因有待进一步探