垂直电泳系统工作原理

垂直电泳系统工作原理教案课程名称分子生物学实验授课题目（章、节）实验二授课教师陈永燕迟彦授课对象生物工程031授课时间8学时教学方法实际操作（分组实验）选用教具授课内容提要及时间分配：（8学时）实验二DNA的检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA紫外风光光度计检测DNA的浓度和纯度[实验目的]通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术[实验原理]DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。[实验步骤]1．制备1％的琼脂糖凝胶溶液；2．封闭有机玻璃内槽，放好梳子，倒胶；3．用移液器将混和了上样缓冲液的DNA样品加入点样孔；4．接通电源电泳；5．观察实验结果[注意事项]1.溴化乙锭是强烈致癌剂，在操作过程中注意戴手套；2.处理稀EB溶液的方法：1）每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭；2）于室温放置1小时，不时搅动；3）用Whatman1号滤纸过滤溶液，滤液可从下水道丢弃；4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物予以丢弃。大连大学教学重点、难点及基本要求：掌握琼脂糖凝胶电泳的分离DNA的原理；制胶流程；制胶注意事项。作业与思考题：1.琼脂糖凝胶电泳实验原理?2.影响电泳迁移的主要因素?3.凝胶上样缓冲液（loadingbuffer）的作用?4.DNA染料EB（ethidiumbromide）的作用?5.琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺分离DNA分子大小范围?6.DNA纯制品，OD260/OD280=？RNA纯制品，OD260/OD280=？什么情况下DNA样品比值偏高或偏低。单元教学小结（经验效果、问题、改进措施、信息反馈等）琼脂糖凝胶电泳检测DNA一：讲解相关知识：1电泳（electrophoresis)：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。2琼脂糖(agarose)：线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取出来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固形成良好的电泳介质。琼脂糖凝胶可形成三维筛孔的通道。3凝胶浓度决定孔径大小凝胶浓度越大，形成的孔径越小，则分辨率越大凝胶浓度越小，形成的孔径越大，则分辨率越小4实验原理：DNA琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定、纯化DNA的分子生物学最常用的技术。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中，向？？移动。5影响电泳迁移的主要因素：琼脂糖浓度DNA的大小DNA的构象缓冲液6分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度7不同构型质粒迁移速率：超螺旋＞线状＞开环DNA8缓冲液TAE：乙酸盐缓冲液TBE：硼酸盐缓冲液TPE：磷酸盐缓冲液TAE缓冲液缓冲能力较二者弱；TAE缓冲液在分离分子量较小的DNA分子时，迁移速率比TBE和TPE快；TAE对于分子量较大的DNA分子，具有较好的分辨率。TPE凝胶回收DNA片段中含有较高的磷酸盐，易与DNA形成沉淀，影响酶反应。9指示剂：凝胶上样缓冲液（loadingbuffer）有三种作用：1.增加DNA密度2.便于加样3.溴酚蓝的迁移速率同300bp的双链DNA分子迁移速率相同。10DNA染料：EB（ethidiumbromide两个特性：它可嵌入到核酸分子的碱基中，但不会和琼脂糖等介质结合。它可在300nm的波长下发出荧光。二：讲解实验原理，步骤，注意事项[实验原理]DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样，迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。一般提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA)，开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，(opencircularDNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA，即质粒DNA在同一处两条链都发生断裂(linearDNA，简称LDNA)。由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。[仪器、材料与试剂](一)仪器1．恒温培养箱2．琼脂糖凝胶电泳系统3．小型高速离心机4．高压灭菌锅5．紫外核酸检测仪(二)材料1．pUC18质粒(三)试剂1．50xTAE(50倍体积的TAE贮存液)配1000mL50xTAE：Tris242g冰醋酸57mL0.5mol／LEDTA200mLpH8.02．凝胶加样缓冲液(6x)溴酚蓝0.25％蔗糖40％3．琼脂糖4．溴化乙锭溶液(EB)0.5μg／mL5．250bpDNA分子量标准[实验步骤](一)制备琼脂糖凝胶根据被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖凝胶浓度％线性DNA的有效分离范围／kb0.35-600.61-20O.70.8-10O.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3实验用1.2％琼脂糖。称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL1xTAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。(二)胶板的制备1．取干净的有机玻璃内槽，用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严，不能留缝隙)。2．将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。3．将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。4．待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。5．加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。(三)加样用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。(四)电泳1．接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5V／cm。2．当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。(五)染色将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200mL1xTAE缓冲液中加两滴2mg/mL的溴化乙锭储存液即可)，在脱色摇床上缓慢摇动下染色20-30分钟。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。[实验结果]在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的伤害作用)。紫外风光光度计检测DNA的浓度和纯度1基本认识:溶液中所有物质都有吸收一种波长的光，而让其他波长的光透过。正象物质的熔点、沸点、密度和溶解度一样，吸收是物质的一种特性。吸收和溶液中物质的量相关，因而它可以被用来测定溶液中物质的量。利用物质特有的吸收光谱来鉴定物质性质和含量的技术，成为分光光度计技术。其理论依据是Lambert定律和Beer定律。灵敏度高，测定速度快，应用范围广2基本概念1)透光度：设光线通过溶液前强度为I0，通过溶液后光的强度为It，则It/I0表示透射光的强度是入射光强度的几分之几，称为透光度，transmittance，用T表示。2)吸光度：透射度的负对数称为吸光度，Absorbance，用A表示。3)朗伯比尔定律：将朗伯定律与比尔定律合并，得A=abca是常数，称为消光系数；b是光程，cm；c是物质的浓度。4)摩尔吸光系数ε：物质的特性常数，是L=1cm,C=1摩尔/升时的吸光度。它依赖于通过物质的光波波长和物质的化学性质吸光度与溶液的浓度和液层的厚度成正比。3分光光度计结构1)光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。紫外区：氢、氘灯。发射185～400nm的连续光谱。2)单色器将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。3)样品室样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。4)检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。5)结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理4分光光度计应用1)测定溶液中物质的含量--核酸的定量2)可以进行物质种类的鉴别吸收光谱曲线：用各种波长的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度－波长曲线，此曲线即为吸收光谱曲线。各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线。核酸的定量:两种方法若样品较纯——分光光度法测定碱基吸收紫外线的量，简单，准确。若样品中DNA或RNA含量较低或含有杂质——EB发出的荧光估测核酸含量。组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特征。最大吸收值在波长250-270之间。DNA在260nm波长下，有强吸收。在波长260nm紫外线下，1OD的光密度=50μg/mL（双链DNA）；1OD的光密度=40μg/mL（单链DNA，单链RNA）；1OD的光密度=33μg/mL（单链寡核苷酸）估计核酸的纯度DNA纯制品：OD260/OD280=1.8RNA纯制品：OD260/OD280=2若DNA样品中混有蛋白质和酚，则比值降低若DNA样品中含有RNA，则比值增高若DNA样品中既含蛋白质，又含RNA，那么比值也可能为1.8。核酸浓度在1ng/μL以上才能可靠的测量A2605分光光度计使用注意事项1.样品的浓度不能过低，或者过高，通常认为测定值在吸光度0.1～1.5范围内误差较小；2.盛液量以2/3为宜，防止溶液溅出。3.混合液不能存在气泡4.不可用手接触比色杯光学面。5.必须使用相同的比色杯测试空白液和样