基于形态、生理、解剖的冬油菜抗寒性评价数学模型构建

基于形态、生理、解剖的冬油菜抗寒性评价数学模型构建

0越冬率对抗寒性的影响【研究意义】冬季，油菜被移到中国北方的干旱地区种植，越来越多的研究人员注意到了油茶的抗寒性。耐寒作物的选择也是油茶研究的热点之一。优异的抗寒性是保障北方冬油菜安全越冬并获得高产的关键,而品种抗寒性鉴定是抗寒育种的基础,油菜抗寒性评价研究对抗寒品种选育至关重要。【前人研究进展】目前,北方寒旱区冬油菜抗寒性鉴定和类型划分主要依据是品种越冬率,孙万仓等以极端低温-28—-24℃条件下的越冬率为依据,将中国北方寒旱区白菜型冬油菜品种划分为4种抗寒类型,即越冬率90%—100%为超强抗寒性品种;越冬率70%—89%为强抗寒性品种;越冬率30%—69%为抗寒品种;越冬率<30%为耐寒性品种。在生产实践中依据越冬率划分品种抗寒类型是比较可靠和相对稳定的方法,但也存在以下几方面的缺陷,(1)费工费时;(2)难以准确区分品种抗寒性的微小差异;(3)同一地不同年份冬季气候条件也不尽相同,同一品种越冬率数值在年际间存在一定起伏;(4)难以利用越冬率对抗寒性进行早期人工选择等。因此,在进行抗寒性评价时还需要形态、生理、分子等评价指标以满足不同研究需要。国内外学者使用不同植物材料已筛选出一些与抗寒性评价相关的形态、解剖和生理生化等指标,主要包括生长习性、根颈直径、地下部干重、叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、上下表皮厚度、栅海比、栅栏组织紧密度、栅栏组织疏松度、叶面气孔面积、气孔密度和气孔的开度等形态解剖指标和半致死温度LT50、组织含水量和束缚水/自由水的比值、渗透调节物质(可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游离脯氨酸含量)、抗氧化酶活性(SOD、POD和CAT)、丙二醛(MDA)等生理生化指标。【本研究切入点】植物抗寒性与多个性状相关,由多基因控制,单一基因对植物的抗寒性仅具有微效调节作用。因此,采用单一指标很难准确判断植物抗寒性,只有用多个指标综合评价才较为可靠。【拟解决的关键问题】本研究在前人对植物抗寒性研究基础上[9,10,11,12,13,14,15,16],从生理、形态解剖等水平对不同油菜品种抗寒性进行研究,利用相关分析、回归分析、聚类分析及通径分析的方法,探究适宜的评价指标,建立综合评价体系,以期对不同油菜种源进行抗寒性鉴定,为油菜抗寒品种选育提供理论依据。1材料和方法1.1供试材料品种特性以白菜型冬油菜陇油6号、陇油7号、陇油8号、陇油9号、延油2号、天油2号和甘蓝型冬油菜Vision7个冬油菜品种为供试材料,品种特性见表1。1.2验基地概况供试材料于2011年8月中旬播种于兰州新区甘肃省油菜工程技术研究中心上川试验基地,小区面积5m×1.5m,行距20cm,株距10cm,重复3次。统计冬前(2011年11月1日)与冬后(2012年3月15日)时苗数,计算越冬率,越冬率=冬后苗数/冬前苗数×100%。1.3低温半致死温测定植物低温半致死温度随着低温锻炼而不断降低,但不同抗寒性品种间强弱变化不同,采用抗寒锻炼过程中的低温半致死温度平均值作为抗寒性评价的基本指标具有可靠性。2011年8月10日,将上述不同抗寒性冬油菜品种的种子在培养皿中进行发芽处理,发芽4d后取生长相对一致的幼苗移栽于盆中,每盆3株,盆直径18cm,高16cm,营养土由蛭石与土壤表土以1﹕1混合而成,定期浇灌MS营养液。分别于2011年10月、11月、12月和2012年1月下旬采集油菜叶片,参照郭海林等的方法进行测定,将处理温度和相对电导率用Logistic方程拟合,求出该曲线出现拐点时的温度,以此作为组织的低温半致死温度。相对电导率拟合logistic回归方程为Y=K/(1+ae-bx),其中,Y代表细胞伤害率,x代表处理温度,K为细胞伤害率的饱和容量,a、b为方程参数。为了确定a、b的值,将方程进行线性化处理,ln[(K-y)/y]=lna-bx,令y1=In[(K-y)/y],则转化为细胞伤害率(y1)与处理温度(x)的直线方程。通过直线回归的方法求得a,b值及相关系数R,半致死温度LT50=ln[(1/a)]/b。1.4叶片形态观察和栅/海比测量采集各品种的第四叶,取叶片中脉部分,切成大小均匀的小片,FAA固定,采用石蜡切片法,在倒置显微镜下观察并测量叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、上表皮厚度、下表皮厚度,并计算栅/海比(P/S)。利用透明胶带粘取法粘取叶片表皮并制片,在Motic数码显微镜40×物镜下观察拍照,用MoticImagesAdvanced图像分析处理系统测定气孔的纵径、横径和张开面积。1.5不同品种油炸根颈直径测定根颈直径测量:2012年1月用数显式游标卡尺测定不同品种油菜根颈直径,设5个重复。地下部干重测量:2012年1月取不同品种油菜根部,80℃烘干测定干重,设5个重复。1.6温度保鲜处理2011年10月每个品种取5盆(共计15株)8叶期幼苗,置于低温试验箱(北京HT/GDW-150高低温试验箱)中进行胁迫处理,按如下程序进行降温冷冻:20℃48h→15℃48h→10℃48h→5℃48h→0℃48h→-5℃48h→-10℃48h。低温试验箱控制温度均匀度≤±2℃,温度波动度≤±0.5℃。用塑料袋包裹盆面以防止干燥冷风引起的强烈蒸发作用使植物严重脱水。每个温度处理结束后取样进行生理指标测定。按照邹琦和赵世杰等的方法进行可溶性蛋白(SP)含量、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、可溶性糖(SS)含量、游离脯氨酸(Pro)含量及丙二醛(MDA)含量的测定。1.7抗寒性综合评价结果与预测回归方程使用office和spss软件,运用皮尔逊法进行相关分析,通过主成分分析、回归分析等方法对各项指标进行综合分析并得到抗寒性评价预测回归方程。2结果2.1各参试材料抗寒力指标一般而言,以越冬率为指标进行田间测定是评价植物抗寒性最直观可靠的方法。许多研究表明,采用LT50衡量植物抗寒性同样具有较高的可靠性。对冬油菜田间越冬率与低温半致死温度进行相关性分析,相关系数为-0.922,达到极显著负相关水平,表明LT50可作为各参试材料抗寒力评价的指标,LT50值越低,抗寒性越强。供试7个品种LT50(表1)分别为陇油6号-5.86℃、陇油7号-5.71℃、陇油8号-4.35℃、陇油9号-4.12℃、延油2号-3.98℃、天油2号-3.23℃和Vision-1.60℃,根据半致死温度对这7个油菜品种抗寒性强弱可做出如下排名陇油6号>陇油7号>陇油9号>陇油8号>延油2号>天油2号>Vision,结果与田间越冬率测定结果(表1)一致。2.2冬油菜品种对生长习性的影响通过对7个冬油菜品种生长习性观察、叶片解剖结构、根颈直径和根部干重测定,发现不同抗寒性冬油菜品种间生长习性、根颈直径、地下部干重、栅海比、栅栏组织厚度、上表皮厚度、叶片厚度、海绵组织厚度、下表皮厚度、气孔面积、气孔密度存在差异。2.2.1半致死温度(LT50)与不同抗寒品种生长习性的相关性通过对表1中生长习性统计结果进行赋值量化,以便进行深层次比较分析。匍匐生长记为3,半直立生长记为2,直立生长记为1,对半致死温度(LT50)与生长习性进行相关性分析,相关系数为-0.864,达到显著负相关水平。匍匐生长的冬油菜品种抗寒性强于半直立和直立生长的冬油菜品种。2.2.2半致死温度(LT50)与不同抗寒品种形态解剖指标的相关性陇油6号栅海比最小,为1.21,其叶片较薄,厚度为284.4μm,甘蓝型冬油菜Vision栅海比最大,为1.52,其叶片最厚,达348.6μm,陇油7号栅栏组织厚度最小,为148.6μm,气孔面积最小,为142.17μm2,而Vision栅栏组织厚度最大,为192.6μm,气孔面积最大,为322.1μm2(图1和图2)。根据相关性分析(表2),发现半致死温度与栅海比、栅栏组织厚度、叶片厚度及气孔面积呈显著正相关,其中与栅栏组织厚度和叶片厚度达到极显著水平。2.2.3冬油菜品种根颈直径和地下部干重变化超强抗寒性白菜型冬油菜品种陇油6号根颈直径最大,为8.83mm,地下部干重最大,为2.2g;不寒性甘蓝型冬油菜品种Vision根颈直径最小,为4.12mm,地下部干重最小,为0.52g。半致死温度LT50与根颈直径及地下部干重均达到极显著负相关(表2),根颈直径越大,地下部干重越大,该品种的半致死温度LT50越低,抗寒性越好。2.3pod和sp活性根据不同品种在不同温度胁迫下的生理生化指标的变化情况(图3),发现在20—15℃时,陇油6号和陇油7号2个品种CAT活性增加最高,温度降低到-10℃时陇油6号和陇油7号CAT活性高于其他品种;20—-10℃变化过程中,7个品种POD活性总体呈先增加后降低趋势;MDA在20—-5℃之间各品种变化较小,之后以0℃为拐点呈先降低后升高趋势;SP含量总体呈现下降、上升再下降趋势,减小量与品种抗寒性显著相关。相关性分析(表3)半致死温度LT50与5—0℃POD变化量、0—-5℃CAT变化量、5—0℃可溶性蛋白变化量及10—5℃游离脯氨酸变化量呈显著负相关,与0—-5℃的POD变化量呈显著正相关,并且与5—0℃可溶性蛋白变化量和10—5℃游离脯氨酸变化量均达到极显著水平。2.4回归分析与聚类分析根据前述各项单因素分析,确立了与油菜抗寒性密切相关的13个生理和形态指标,依次为不同品种低温半致死温度LT50、5—0℃POD活性变化、0—-5℃POD活性变化、0—-5℃CAT活性变化、5—0℃SP变化量、10—5℃Pro变化量、栅海比、栅栏组织厚度、叶片厚度、气孔面积、生长习性、根颈直径和地下部干重。通过主成分分析、回归分析、聚类分析和通径分析对上述指标进行综合评价。2.4.1主成分分析通过主成分分析(表4),提出1个主成分,包含所确定的13个指标中的绝大部分信息(累计贡献率为88.291%),包括组织膜透性、POD、CAT、SP、Pro以及叶片组织结构特点、生长习性、根颈直径和地下部干重等指标的信息,因此,可以利用这个主成分来对不同品种油菜进行抗寒性评价。表5给出了7个不同的油菜品种在所提取的主成分中得分,直接对7个油菜品种的抗寒性进行评价,得分越高则该品种低温半致死温度越低,抗寒性越好,据此得到不同品种初步抗寒性顺序为:陇油6号>陇油7号>陇油8号>陇油9号>延油2号>天油2号>Vision,抗寒性鉴定结果与田间越冬率测定结果一致。利用主成分分析法所得到的结果并不十分精确,只能作为抗寒性强弱的初级判定方法,要想做到准确无误,还需要在此基础上利用其他一些多元数理统计方法来解决不同油菜品种抗寒性评价问题。2.4.2回归分析与回归方程的确立利用筛选出与冬油菜抗寒性密切相关的指标,建立抗寒性评价数学模型,即回归方程,通过相关指标测定来得到半致死温度LT50,进而对不同油菜品种抗寒性做出评价。据多元回归分析的原理,以低温半致死温度LT50为因变量,以5—0℃POD变化量、0—-5℃POD变化量、0—-5℃CAT变化量、5—0℃SP变化量、10—5℃Pro变化量、气孔面积、叶片厚度、栅海比、栅栏组织厚度、生长习性、根颈直径和地下部干重为自变量,利用SPSS软件作回归方程。当Fto-enter≥3.84并且Fto-remove≤2.71时,10—5℃Pro变化量、0—-5℃SP变化量、栅海比、气孔面积、生长习性和地下部干重6个指标被引入回归方程,如下:Y=-7.58-0.018X1-0.542X2+3.903X3-0.002X4+0.195X5-0.066X6,(R2=1.000),其中,Y为半致死温度,X1为10—5℃Pro变化量,X2为0—-5℃SP变化量,X3为栅海比,X4为气孔面积,X5为生长习性,X6为地下部干重,R2为拟合度。对所得方程估计精度进行评价(表6),采用数值回代法,用计算得到的半致死温度与之前测定的低温半致死温度进行比较。回归方程估计精度极高,均在94%以上,证明回归方程中引入的6个指标对油菜抗寒性影响明显,该回归方程可以应用于不同冬油菜品种抗寒性评价。2.4.3聚类分析依回归方程中所引入的6个指标和低温半致死温度,对7个不同油菜品种进行抗寒性分类,共分为5类(表7),第1类:陇油6号,陇油7号。此类表现特征为低温半致死温度LT50最低,10—5℃温度变化条件下Pro含量增加最大,0—-5℃SP含量增加最大,栅海比最小,气孔面积最小,根颈生长习性为匍匐生长,地下部干重最大。第2类:陇油8号。该类特征是半致死温度LT50较低,Pro含量和SP含量增加仅次于第1类,栅海比较小,气孔面积小,生长习性为匍匐生长,地下部干重较大。第3类:陇油9号,延油2号。该类别特征为半致死温度LT50较高,Pro和SP随温度减低其含量增加较小,栅海比中等,气孔面积较大,生长习性接近直立生长,地下部干重较小。第4类:天油2号。此类别特征为半致死温度LT50高,温度在10—5℃的下降过程中Pro含量略有增加,0—-5℃SP含量减小,栅海比较大,气孔面积也相对较大,生长习性为直立生长,地下部干重小。第5类;Vision。此类特征为半致死温度最高,Pro和SP含量随温度降低增加量最少,栅海比最大,气孔面积最大,表现为直立生长,地下部干重最小,居参试品种末位。2.4.4通径分析通过对上述指标进行通径分析(表8),结果表明,可溶性蛋白的含量变化对冬油菜抗寒性有直接影响,降温时可溶性蛋白中出现高度亲水的糖蛋白,具有高效水分束缚能力,增加细胞持水能力。蛋白质作为细胞膜的组成成分,影响膜的发育,增加对低温造成胞间结冰和脱水的抗性,另外,诱导产生抗冻蛋白也是冬油菜抵抗严寒的重要途径。同时Pro含量和地下部干重通过影响可溶性蛋白含量变化间接对冬油菜抗寒性产生影响。3抗寒性与肉质及提出物北方寒旱区冬油菜抗寒性的鉴定和划分主要依据是品种的越冬率。本研究发现越冬率与半致死温度达到极显著负相关,说明采用半致死温度评价冬油菜抗寒性是可行的。许瑛等发现菊花脚芽返青恢复生长性能与当月半致死温度测定结果基本一致,表明采用半致死温度可作为菊花抗寒性评价的可靠指标。低温胁迫下植物体内活性氧含量大幅增加,破坏生物膜系统,造成植物体内渗透调节失衡,过氧化物酶和过氧化氢酶能有效清除体内活性氧和自由基,保护生物膜系统氧化损伤。何若韫等发现植物体内的游离脯氨酸,可作为渗透调节剂和冰冻保护剂对低温生长和贮藏期间植物的抗寒性有非常重要的作用,并且随着低温胁迫时间的延长其含量增加,说明植物的抗寒性与游离脯氨酸含量密切相关。可溶性蛋白是亲水物质,其含量的增加可以显著提高细胞的保水能力,作为植物体内的保护性物质参与植物抗寒。Heber指出冬小麦抗寒的原因主要依赖于低温下可溶性蛋白质含量的稳定增加。Kacperska-Placz等在低温处理的冬油菜叶片内发现了两种可溶性蛋白的增加,分子量在25.5—30kD,并存在于细胞质中。本研究表明5—0℃POD变化量、0—-5℃CAT变化量、5—0℃可溶性蛋白变化量及10—℃游离脯氨酸变化量呈显著负相关,与0—5℃的POD变化量呈显著正相关,并且与5—0℃可溶性蛋白变化量和10—5℃游离脯氨酸变化量均达到极显著水平。在长期自然选择过程中,植物的生长习性及形态,解剖结构逐步朝着适应外界环境的方向进化。对于冬油菜而言,抗寒性强的品种冬前地上部生长缓慢,植株匍匐生长,地下部生长快,肉质根膨大期早,根颈直径大,生长点下陷于表土下。植物叶片气孔面积的大小直接影响其蒸腾作用,气孔面积小,蒸腾作用弱,水分散失变慢,有利于植物抵抗外界低温。抗寒性弱的品种,冬前地上部生长快,植株呈直立生长,叶片较厚,枯叶期晚,根颈直径较小,生长点裸露于地表。本研究表明栅海比、栅栏组织厚度、叶