植物病原线虫的分离方法及形态观察实验

植物病原线虫的分离一、 目的要求了解从土壤和植物组织中分离线虫的基本原理，掌握从土壤和植物组织中分离线虫的常用方法。学习在解剖镜或扩大镜下用银子、竹针、毛针、毛笔等工具从水中和滤纸上挑取线虫的方法。二、 基本原理植物寄生线虫主要存在于土壤和植物组织中，分离线虫的方法有许多，要根据线虫的种类、研究目的等来选择适宜的方法。植物寄生线虫的个体很小，除极少数可从植物组织中直接挑出以外，绝大多数需借助特定的工具和方法才能完成。线虫的分离主要是利用它的趋水性、大小、比重以及与其他杂质的差异，采用过筛、离心、漂浮等措施，将线虫从植物组织、土壤中分离出来。三、 材料、试剂与仪器1．实验材料感染根结线虫病的植物病根、病土、感染大豆孢囊线虫或其它孢囊线虫的病土、感染甘薯茎线虫的病薯块等。2．仪器或实验用具解剖镜、漏斗分离装置、漂浮分离装置、浅盘分离装置、纱布或铜纱、记数皿或平皿、小烧杯、小玻管、旋盖玻璃瓶、40目和325目网筛、线虫滤纸、餐巾纸、挑针、竹针、毛针、毛笔等。3．试剂线虫固定液四、实验操作1．直接观察分离对于个体较大的线虫如根结线虫、孢囊线虫、粒线虫的雌虫等，可直接用挑针从植物组织中挑取，也可在解剖镜或扩大镜观察下直接挑取，对于虫体稍小的线虫如茎线虫、粒线虫的雄虫和幼虫等，需在解剖镜下，用竹针或毛针直接挑取。取感染根结线虫的植物病根材料（若是干材料需用水浸泡过夜），剥开皮层，观察里面是否有针头大小、乳白色发亮的颗粒状物。用挑针挑取，置凹玻片上水滴中，在解剖镜或显微镜下观察是否为根结线虫雌虫。2．漏斗分离法该方法操作简单，是目前从植物材料中分离线虫较好的方法。其装置是将直径10~15cm的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10cm的橡皮管，橡皮管上装一个弹簧夹。（1）将植物材料切碎用双层纱布包好，浸在盛满清水的漏斗中，或在漏斗内衬放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将植物材料直接放在网筛中，分离土壤线虫时需在网筛上放一层纱布或多孔疏松的纸，上面加一层土样。（2）加水，静止24h。提示由于趋水性和自身的重量，线虫就离开植物组织或土壤，沉降到漏斗底部的橡皮管中。（3）打开弹簧夹，慢慢放出底部约5ml水样于平皿内。（4）在解剖镜下观察分离到的线虫。若线虫数量太少，可将水样倒入离心管中，在1500rpm离心机中离心3min，倒掉上层清水，将下层沉淀物悬浮后倒入平皿或记数皿中，在解剖镜下观察记数，然后将线虫用毛针或毛笔挑入盛有固定液的小玻璃管中备用。提示该方法也可用于分离土壤中的线虫，尤其是分离较为活跃的线虫。3．培育分离法对于用漏斗分离法不易分离到的线虫，如根结线虫和孢囊线虫的雄性成虫等，可采用培育分离法。将病根采回后洗去表面土粒，放在培养皿中湿润的滤纸上培育3d,用少量清水冲洗组织和皿底，检查水中线虫。或将组织放在有螺旋盖的玻瓶中，加入几毫升清水，盖不要旋紧，在室温(20~25°C)下培育3d，然后加50ml清水，盖紧盖子并轻轻振荡，后倒出悬浮液使其顺序通过40目和325目网筛，用小水流轻轻冲洗325目网筛背面，收集到记数皿或烧杯中，直接检查或离心后检查。提示从土壤中得到病根后要马上冲洗和培育，因为24h后，有50%的线虫会从根里爬出，冲洗时便被冲掉了。4．浅盘分离法该方法原理与漏斗分离法一样，但分离效果更好，而且泥沙等杂物较少。用两个不锈钢浅盘套放在一起，上面一个是筛盘，它的底部是筛网，网目大小为10目/英寸，下面一个是稍大的盛水盘。也可在培养皿上放置一个稍小的做成浅盘状的金属网，网与培养皿底部保持一定距离。分离时将线虫滤纸放在网上用水淋湿，上面再放一层餐巾纸，将要分离的土样或植物材料放在餐巾纸上，在两盘之间缝隙中加水，淹没土样或植物材料，在室温（20~25C）下保持3d,去掉筛网后，将下面浅盘中的水样过筛（上层为25目，下层为400目）,将下层筛上的线虫用小水流冲洗到记数皿中,观察记数。5．漂浮器分离法对于没有活动能力的孢囊线虫的孢囊可采用漂浮器分离法（Fenwick-Oostenbrink改良漂浮法）,该法需要特制的分离装置。分离时先将漂浮筒内盛满清水,将100g风干的土样放在上筛中,用强水流冲洗土样,使其全部洗到漂浮筒内,并从环颈水槽流到承接的细筛（100目）中,再用细水流冲洗一会,使漂浮物全部流入细筛。将细筛中的孢囊等漂浮物用水洗入烧杯或三角瓶中,再倒入铺有滤纸的漏斗中,用毛笔收集并观察滤纸上的孢囊。提示漂浮分离的土样必须要风干，否则抱囊不能在水中漂浮，需用比重小于 1的溶剂。五、所需时间流程|[x] +漏斗分离样品浸泡——放出水浸液、离心 镜检凶培育分离样品培育 过筛、收集、镜检面]I浅盘分离样品浸泡□样过筛、收入记数皿、镜检4•漂浮分离10min左右。六、实验作业比较各种线虫分离方法的优缺点。一、目的和要求识别主要植物线虫病的症状和病原线虫的形态特征。包括雌雄同型及异型线虫.二、材料和用具草莓芽干尖线虫(Aphelenchoidesbesseyi)或珠蓝线虫；小麦粒线虫(Anguinatritici)，破坏性茎线虫(Ditylenchusdestructor)，寄主甘薯，南方根结线虫(Meleidogynearenaria)，寄主花生等；大豆胞囊线虫(Heteroderaglycines)；长针线虫(Longidorussp.);毛刺线虫(Trichodorussp.)。寄生性线虫病的危害状标本或幻灯片。线虫的固定液有多种，常用的有FA、FAA和TAF等三种：(1)FA液：福尔马林(36％甲醛)10ml，蒸馏水90ml;FAA液：福尔马林10ml，冰醋酸1ml,蒸馏水89ml，TAF液：三羟基乙胺2mi，福尔马林7m1，蒸馏水91ml。三、内容与方法1线虫形态的观察(1)粒线虫属(Anguina)观察由小麦粒线虫危害小麦引起的症状，注意小麦受害部位，受害的茎叶有无扭曲或畸形虫瘿的外形与麦粒有什么区别取虫瘿一个，用刀片切开或挑针挑破，挑取虫瘿内部的白色棉絮状物于载玻片上的水滴中盖上盖玻片，置于低倍镜下镜检，可见到成虫、卵和幼虫。雌虫、雄虫均为线形，雌虫体形较雄虫粗大，往往卷曲，体内的卵巢顶端弯曲。雄虫昆部有交合刺，交合伞几乎包到尾尖。(2)茎线虫属(Ditylenchus)观察甘薯茎线虫(D．destructor)危害甘薯的症状，剖开病薯可见到条点状褐色或白粉干腐症状，挑取少量组织于载玻片的水滴中，加盖玻片镜检，可见到卵、幼虫、成虫等各个虫态。甘薯茎线虫雌雄同型，都是线形，雌虫稍粗大，尾端尖细。注意口针、食道球形态，肠和卵巢平行，单卵巢，卵单行排列。雄虫较细小，尾部可见交合刺、交合伞，交合伞后端距虫体末端有一定间隔。因虫体很小，观察内部器官需用高倍镜。观察示范镜下的雄虫尾部形态。(3)滑刃线虫属(Aphelenchoides)有各种危害状，例如水稻(Rice干尖线虫(A.besseyi)引起水稻(Rice)干尖线虫病，以剑叶的干尖最明显，剑叶尖端 2－6厘米一段变为白色。干枯卷缩，幼穗形成时线虫侵入颖壳内，引起秕粒或不很充实；菊叶线虫（）为害菊的叶片，使叶片组织坏死。镜检水稻（Rice）干尖线虫或珠蓝线虫，观察口针、食道球的形态特征、雄虫尾部的交合刺，有无交合伞（4）胞囊线虫属（Heterodera）观察大豆胞囊线虫（H.glycines）的危害症状。挑取病根上的雌虫，肉眼可见到线虫头部已钻入寄主组织，虫体外露，多为柠檬形，黄褐色。制片镜检，大豆胞囊线虫的卵大多不排出体外，整个雌虫体后期变成颜色深褐的卵囊，特称为胞囊（少数可排部分卵于体尾的胶质囊内）。（5）根结线虫属（Meloidogyne）观察蔬菜根结线虫（M.spp.）或花生、茄科植物根结线虫危害症状，镜检观察雌虫虫体形态。根结线虫属分种的主要依据是：会阴花纹的形态特征，胞囊线虫分种是根据阴门椎周围的形态特征加以区别的。（6）外寄生线虫这类线虫只有取食时才将口针穿刺到寄主植物的体内，虫体外露，平时生活于土壤中。由于取食与栖息不在一处，它们经常往返于土壤与植物根系之间，而且取食的植株不固定，一条线虫可以危害多株植物。在它们转移危害时，线虫往往成为其它病害的传播介体，例如烟草环斑病毒(TRSV就是通过线虫传播的。剑线虫属(Xiphinema)：齿针很长，基部球大为瘤状，导环位置低。长针线虫属(Longidorus):齿针很长，基部球不大，导环位置高。毛刺线虫属(Trichodorus):瘤针弯曲，

基部渐粗，形似毛刺L■佃百存琶州ct基部渐粗，形似毛刺L■佃百存琶州ctrl■暫BS二粧在示范镜下观察比较外寄生线虫头部及口针部的形态特征。2线虫的杀死、固定和线虫死活的鉴别线虫活体的形态特征是线虫工作者初步区分线虫种类的一个重要指标，但是要进一步区分和鉴别它们，必须经过杀死、固定以后才能作仔细的分辨，有的还要经过局部加工处理，使特征部位显示出来才能确定。因此，杀死并很好地固定线虫十分重要，否则就不能将线虫标本很好地保存下来。2．1线虫的杀死少量线虫的杀死是用毛针或竹针将线虫挑放在有水滴的载玻片上，水滴部分在酒精灯火焰上来回移动3-4次，使水滴温度升高，当弯曲的线虫突然伸直时立即停止加热，此时虫体已被杀。大量线虫的杀死是将线虫放在表面皿或小玻皿中，加入等量的沸水；也可将盛有线虫液的玻管直接浸入60-65水浴中浸2－3分钟，不断振摇使加热均匀，当线虫僵直时停止加热。2．2线虫的固定与保存杀死后的线虫用毛针移放到FAA或TAF固定液中，操作要在解剖镜下完成。福尔马林液可使虫体硬化，不腐败；乙酸则使角质膜膨胀，但乙醇可使表皮皱缩变形。标本在FAA液中不宜保存太久，在TAF液中则可长期保存。线虫在固定过程中要逐步更换固定液，通常是每隔3－4小时即吸去表层液，约1／2的容积，并加进新的固定液，连续换液3-4次后即可长期保存。2．3线虫死活的鉴别方法从土壤或种苗材料中分离得到的线虫，有时都不活动，对于它们是否存活需作鉴定，这在药剂处理试验中最为重要。（1）高锰酸钾染色法：在凹玻片上加一滴0．5-1%的KMnO4液，然后挑放数条线虫在溶液中，经1—2分钟后在显微镜下观察，死线虫已染成棕红色，活虫不易染色。（2）盐水实验：试蕴：将线虫挑放到凹玻片上的2-5%NaC1液中，经3-5分钟后在显微镜下观察，死虫无反应，活虫则卷曲或活动剧烈。四、作业与思考题绘小麦粒线虫雌虫、雄虫体形图，注意交合刺、交合伞。绘滑刃线虫雄虫尾部图，注意有无交合伞（1）植物寄生线虫的致病特点是什么（2）根结线虫和胞囊线虫为害根部时，症状有何不同（3）哪一种方法鉴别线虫死活简便植物病原线虫及其所致病害症状观察一、目的线虫是一种低等无脊椎动物，在自然界中分布广泛、种类繁多、形态各异；寄生在植物上的线虫，从某些种类和造成的经济损失上看，仅次于真菌、细菌和病毒，而且常与其它病原物一起造成复合侵染。植物受线虫危害后表现的症状与一般的病害症状相似，因此称为线虫病。近年来，线虫病害发生日趋严重，所以线虫的研究愈来愈受到人们的重视。本实验的目的是熟悉植物病原线虫的基本形态及其所致病害的症状特点，以及学习分离和鉴定主要植物病原线虫的方法。、内容、材料和方法、内容、材料和方法(一)植物线虫病害症状类型观察植物受线虫为害后，除和真菌、细菌、病毒等病原物引起的相似症状，也有其特有症状与之相区别，线虫多在地下活动，根部受害比较多见，根部受害的症状，有的根生长点受破坏而停止生长或卷曲，有的根上形成瘤肿或过度分枝而形成发根或须根团；植物根部受害后，地上部生长受到影响而表现植株矮缩，色泽失常和早衰，严重时整株枯死；植株地上部的症状，有顶芽和花芽坏死，茎叶卷曲或组织坏死，形成叶瘿或种瘿等。植物病原线虫不同属所致症状也有一定的区别，根结线虫属 (Meloidogyne)和胞囊线虫属(异皮线虫属Heterodera)所致病害地上部一般无特异症状，仅表现生长不良、植株萎黄，地下部须根明显增多，往往形成须根团；根结线虫刺激根部肿胀形成根结， 而胞囊线虫则不形成根结， 但可直接看见附着根侧的雌虫体；粒线虫属(Anguina)为害地上部分，使茎叶扭曲，穗部变形，籽粒变为虫瘿；茎线虫属 (Ditylenchus)主要为害地下部分，使块根、块茎、鳞茎呈干腐状或湿腐状，地上只略见茎叶呈波状卷曲、发育迟缓等；而滑刃线虫属(Aphelenchoides)为害叶片和芽而引起局部干枯坏死等。观察下列线虫标本，注意症状特点：小麦粒线虫病(Anguinatritici)；甘薯茎线虫病(Ditylenchusdipsaci)；水稻干尖线虫病(Aphelenchoidesbesseyi)；花生根结线虫病(Meloidogyneincognita)；大豆胞囊线虫病(Heteroderaglycines)；甘薯根结线虫病(二)分类及主要属形态观察关于线虫分类地位，以前放在线形动物门(Nematelminthes)的线虫纲(Nematoda)中，但多数学者主张单设线虫门(Nemata)，这种观点已被接纳。根据线虫尾部侧面感觉孔一一侧尾腺口的有无，线虫纲分为侧尾腺口纲(Secernentea)和无侧尾腺口纲(Adenophorea)两个纲，植物寄生线虫绝大多数在侧尾腺口纲中，其中主要是垫刃目(Tylenchida)的线虫对植物有致病性，特别是该目中垫刃总科(Tylenchoidea)和滑刃总科(Aphelenchoidea)中的一些线虫，以下学习五个重要属。H2US-J■J1粒线虫属(Anguina)(粒科Anguinidae)H2US-J■J1切取浸泡的小麦粒线虫病虫瘿制片镜检，注意观察虫体形态，雌成虫虫体呈肥胖卷曲状。颈部缢缩,肛门孔退化，雄成虫虫体细长，略弯，交合伞包至尾尖。22植物病原线虫包括那些重要类群 这些类群是怎样划分的茎线虫属（Ditylenchus）（粒科Anguinidae）挑取甘薯茎线虫病病组织制片镜检雌雄虫体形态，注意雌虫阴门位置，雄虫交合伞不包至尾尖，交合刺基部变宽，并有突起等特点刺基部变宽，并有突起等特点胞囊线虫属（Heterodera）（异皮科Heteroderidae）取漂浮器分离到大豆胞囊线虫的胞囊在解剖镜下观察形状，颜色，区分头尾部，然后在低倍显微镜下压破胞囊（或取制备片）镜检卵或二龄幼虫的形态。根结线虫属（Meloidogyne）（异皮科Heteroderidae）镜检花生根结线虫制备片，注意雌雄成虫的形态和胞囊线虫属有何不同虫卵产于何处rf•-IIIT■；VTflIHkliltilf«1hrf•-IIIT■；VTflIHkliltilf«1h 止刁审事祈■W>«4 4-4*44:■絶■ft■