分子生物实验

分子生物实验一、名词解释（5×3’）1.Plasmid:质粒，是细菌染色体外的遗传物质，是染色体外小型双链环状的DNA，大小在1-200kb之间，质粒能自主复制，在细菌中不断复制自身。2.Polymerasechainreaction:聚合酶链反应：即PCR技术，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。包括高温变性（94℃）-低温复性（50-60℃）-中温延伸（72℃）三个过程。3.RecombinantDNA:DNA重组：就是采用人工手段将不同来源的DNA片段进行重组，以达到改变生物基因型和获得特定基因产物的目的的一种生物技术。简言之，外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组。4.Blue-whitescreening:蓝白斑筛选：重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子。5.Shuttleplasmidvector:穿梭质粒载体：是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。这些穿梭质粒载体不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。6.Competent:感受态：细菌处于易吸收外源DNA的状态称感受态，其原理是细菌处于0℃Calc2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。7.multiplecloningsites:多克隆位点：MCS,是包含多个（最多20个）限制性酶切位点（restrictionsite）的一段很短的DNA序列。也称为多位点接头（polylinker），往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的DNA序列。8.αComplementary:α互补：Lacz基因编码的α肽链同失去了正常氨基末端的β-半乳糖苷酶突变体的互补现象为α互补。LacⅠ（半乳糖苷酶）有两个主要的亚基，α亚基和ω亚基，前者的DNA序列很短，后者比较长。α与ω相结合就能表现出半乳糖苷酶活性。所以大部分基因工程菌株的基因组上都有ω亚基的序列，但是敲除了α亚基序列，默认只表达ω亚基，不会有半乳糖苷酶活性。但是如果转化的质粒上有连续完整的α亚基序列，那么就会表达α亚基，产生“α互补”，表现出LacZ活性。9.Recombinant:重组子：含有重组DNA分子的转化细胞。二、填空（15×1’）1.在大肠杆菌感受态细胞的制备实验中，第6步加入Calc2的目的是：洗净前一步残留的LB液体，Calc2的目的是：保存细胞，使其处于感受态。2.质粒DNA的提取实验的原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。3.琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验中，DNA分子的迁移速率取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。4.Loading-buffer的中文名称是上样缓冲液。5.dNTP是dATP、dGTP、dCTP、dTTP的统称。6.酵母转化的方法主要有三种，分别是醋酸锂转化法、原生质体转化法和电转化法（粒子轰击转化法），其中醋酸锂的作用是其中的Li+可以中和DNA和细胞膜脂所带的负电荷，同时它还可以在细胞膜上形成小的弘道，以便于DNA分子进入细胞，聚乙二醇的作用是能增加细胞膜的聚集，促进DNA分子粘附在细胞表面，增强转化率。7.在大肠杆菌感受态细胞的制备实验中，我们使用的大肠杆菌种名为：DH5α。8.在质粒DNA的提取实验中，Tris饱和酚、氯仿、异戊醇三种成分的作用分别是使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用、加速有机相与液相分层、可以降低表面张力，从而减少气泡产生并有助于分相。9.dNTP的中文名称是三磷酸碱基脱氧核苷酸，dATP、dGTP、dCTP、dTTP的中文名称分别是三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸。10.DNA重组的方法主要有黏端连接法和平端连接法。11.表达载体应具有的几种元件包括：选择标记的编码序列，控制转录的启动子，多克隆位点（MCS），控制转录的终止子和自主复制序列，转录调控序列，核糖体结合位点。四、简答题（5×6’）1.简述SDS电泳技术检测蛋白质实验步骤？①把玻璃板洗净后用蒸馏水冲洗，晾干，准备2个干净的小烧杯。②把玻璃板在灌胶支架上固定好。③配置12%分离胶。④按比例配好分离胶，用移液枪快速将分离胶加到玻璃板缝隙中，距短板上沿约2cm加少量蒸馏水，静置至胶凝固30min。⑤用滤纸把上层的水吸干，按比例配浓缩液，沿边缘连续平稳加入至离短板5mm处，迅速插入梳子，静置到胶凝固，梳子需一次拔出，梳口处不得有气泡，梳底需水平。⑥在内槽中加入电泳缓冲液，将内槽置于外槽内，外槽也加电泳buffer。⑦上样：将各时间段的样分别取10µl加到样孔中，上样时记清顺序。⑧接通电源：80V恒温电泳至溴酚蓝注入分离胶，再用160V至溴酚蓝距下边0.5-1cm停止电泳。⑨撬开玻璃板，剥胶。注意分离胶要完整，做好标记后放至有考马斯亮蓝的培养皿中染2h后，用脱色液脱色（期间更换脱色液2-3次），直到蛋白质条带清晰，观察结果并拍照保存。2.酵母表达载体与一般的细菌表达载体有哪些相同点和不同点？相同点：要经过目的基因的获取，目的DNA片段的扩增，载体与目的DNA片段的连接，连接产物的转化和转化后重组子的鉴定。不同点：酵母表达载体多为穿梭质粒载体，并且目的基因DNA片段与T4载体连接、转化、鉴定后再用酶切目的DNA（5wbp）连接，再用PGBK7EKQ载体连接、转化、筛选、鉴定；用于筛选标记基因主要有营养缺陷型互补基因和显性基因两大类。一般细菌表达载体的载体不是穿梭质粒载体，并且目的基因DNA片段只需一种载体即可鉴定筛选，一般用蓝白斑筛选原理，比如在羧苄青霉-gal、IPTG的选择平板上，涂布进行筛选。3.简述质粒DNA提取实验中，溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用？溶液Ⅰ：其中的葡萄糖能够悬浮大肠杆菌、Tris-HCl缓冲液能控制溶液的pH值、EDTA螯合大肠杆菌中的金属离子。溶液Ⅱ：其中的NaOH碱裂解大肠杆菌的细胞膜，2%SDS是沉淀剂。溶液Ⅲ：其中的乙酸钾作用是使沉淀能力更强，冰醋酸是中和多余的氢氧化钠。4.简述琼脂糖凝胶电泳检测DNA的步骤？1.

将有机玻璃内槽洗净晾干，放置于水平制胶器内，并架好样品梳子。2.制胶：配置适宜浓度的琼脂糖凝胶，准确称量0.15g琼脂糖干粉，放入洗好的锥形瓶内，加入15ml0.5×TBE（用量筒量取后，用纸盖盖着锥形瓶的口，）放入微波炉内加热融化，然后冷却片刻，加入1µl核酸染液，混匀，然后倒入架好的有机玻璃内槽中，待其凝固。3.拔梳子：室温下20-30min后，有机玻璃的内槽的凝胶形成一层均匀的胶面，小心拔出梳子。4.将有机玻璃内槽连同凝胶拔出，放入电泳槽内，向电泳槽内加入电泳缓冲液（0.5×TBE），其量以没过胶面1mm为宜。5.加样：分别取20µlDNA和20µlloadingbuffer混匀，用移液枪将混匀的样品缓缓加入点样孔中（每样孔7µl）。6.接通电源：红色为正极，黑色为负极，DNA样品由负极向正极移动，一般选择80V电压，电泳时间为30min。7.当溴酚蓝移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。8.电泳完毕，关上电源，取出凝胶，在染色体投射仪下，观察结果。5.简述聚合酶链反应的原理和过程？原理：类似于DNA的天然复制过程。反应体系为：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。包括高温变性（94℃）、低温复性（50-60℃）、中温延伸（72℃）三个过程。1.根据模板，设计引物。2.在0.2PCR管内配置25µ反应体系：2.5mmol/LdNTP混合物2µl10×PCRbuffer2.5µl正向引物1µl反向引物1µl模板DNA0.5µlTaq聚合酶0.5µl双蒸水17.5µl3.根据条件，设计PCR程序，进行扩增。①94℃预变性5min②94℃变性30s③55℃退火30s④72℃延伸1min⑤重复②③④30次⑥72℃总延伸5min4.琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果1%琼脂糖凝胶，25µlPCR产物+3µlloadingbuffer，点6个孔。第一个孔加3µlmaker，后5个各点5µl产物。7.蓝白斑筛选的原理的什么？原理:任何携带β-半乳糖苷酶基因（lacZ基因）的质粒载体转化了染色体基因组中中存在这种β-半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生有功能活性的β-半乳糖苷酶，经IPTG诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落；而当外源DNA片段插入到LacⅠ’中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β-半乳糖苷酶互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β-半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色的。8.pET系列的原核表达载体中外源基因在大肠杆菌中诱导表达的原理是什么？当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导在这个操纵子系列中，真正的诱导剂并非乳糖本身，而是半乳糖，后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白使蛋白质构象发生变化，导致阻遏蛋白与0序列解离发生转录。异丙基硫代半乳糖（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定。因此，被广泛用作乳糖操纵子模型的诱导剂。pET原核表达载体中，T7启动子下游有一个lac操纵子序列，重组质粒转化带有染色体T7RNA聚合酶基因的大肠杆菌中，在培养基系列中加入IPTG诱导T7RNA聚合酶生产，继而质粒上的目的DNA开始转录。9.酵母lacZ报告基因的检测方法有哪些？其中lacZ报告基因酶活性检测的原理是什么？检测方法：酶活性检测原理：ONPG（2-硝基-β-D-吡喃半乳糖苷）为无色物质，在β-半乳糖苷酶的作用下可被水解为半乳糖和黄色的邻-硝基苯酚（ONP），因此可以通过培养液颜色变化在410-420nm波长处测知β-半乳糖苷酶的活性。10.酵母表达载体筛选标记的类型有哪些？结合每种类型的筛选标记，简单举例说明酵母表达载体筛选标记是如何发挥作用的。类型有：营养缺陷型互补基因和显性基因两类。①互补基因：如Leu,TRP等，像leu营养缺陷型，当连接目的DNA片段的载体转化入酵母感受态细胞时，能使载体片段上编码leu合成基因表达，那此时转化后的酵母表达载体感受态细胞不需要培养基中加入leu即可生长。②显性基因编码产物主要是显性物质的抗性蛋白，如Cph,cat等，即载体有cph等抗性基因与目的DNA连接导入酵母感受态细胞后，能产生抗cph，即在含cph的培养基中能生长，即达到筛选的目的。五、实验设计（2×15’）1.请设计一个实验，纯化PUC-18质粒双酶切后的产物。①100µlPCR产物补水至200µl，加等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇，漩涡混匀，12000r/min离心5min，取上清（约120µl）②加等体积氯仿：异戊醇，漩涡混匀，12000r/min离心5min，取上清（约100µl）③加等体积无水乙醇（冰上预冷）和1/10体积3M醋酸钠（pH5.2），充分混匀，沉淀DNA④手动短时离心3-5s，冰上沉淀30min⑤12000r/min离心10min，弃上清⑥用200µl70%乙醇洗涤沉淀1次（12000r/min），弃上清，空中干燥⑦加入20µlTE，溶解⑧电泳检测3.如何确定一种新细菌中是否含有质粒？设计实验，提取已知细菌中的质粒？判断细菌中是否含有质粒的方法：①抗氨苄青霉素等抗性基因的筛选；②直接提取总的DNA，然后电泳酶带；③用已知同种属或近似属含质粒或不含质粒的菌株作对照试验提取质粒的方法：①先在3mlLB液体培养基中加入3µl羧苄青霉素（终浓度为50µg/mol），然后接入一个含PUC-18质粒的DH5α单菌落，37℃震荡过夜培养②将过夜培养的菌液加入1.5ml至离心管中，4000r/min离心1min，吸去培养液，将所有菌体细胞收集于离心管中③加入100µl溶液Ⅰ于各菌体细胞的离心管中，漩涡震荡将细菌沉淀悬浮，室温放置10min④加入200µl溶液Ⅱ（新配置）轻轻混匀内容物，溶液逐渐变清后加入溶液Ⅲ（千万不要用漩涡振荡器，裂解时间不要超过5min）⑤加入150µl溶液Ⅲ（冰上遇冷）盖紧管口，轻轻混匀数次，冰上放置15min，使质粒DNA复性（颠倒混匀）⑥12000r/min离心10min，将上清转至另一1.5ml离心管中⑦向上清中加入等体积的氯仿：异戊醇，涡旋混匀，12000r/min离心5min，吸取上清液⑧向上清中加入等体积的氯仿：异戊醇，涡旋混匀，12000r/min离心5min，转移上清液⑨向上清中加入2倍体积无水乙醇，漩涡混匀，室温放置30min，12000r/min，离心10min，弃上清⑩用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀1次，12000r/min离心5min，弃上清，空中干燥。⑪加入20µlTE缓冲液，使质粒DNA完全溶解，-20℃保存。现已知基因A编码区序列信息，请设计一个实验，将A基因克隆到表达载体中。4.现已知一个基因编码区的序列信息，请设计一个实验，将该基因克隆到表达载体中。基因克隆实验的过程：获得基因序列：通过RT-PCR或基因组数据库获得→引物设计及PCR扩增目的片段→PCR产物连接到载体上构建重组载体→重组载体转化到大肠杆菌中进行质粒扩增或表达蛋白①设计引物以该基因cDNA为模板，对目的基因进行扩增。②回收目的基因DNA片段。③将目的DNA片段与T载体（PGEM-T）进行连接（16℃，15h）④将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞涂布PAMP抗性平板。⑤对大肠杆菌转化子进行鉴定（PCR，质粒酶切，测定）。⑥选取一个鉴定序列正确的转化子，接入20µl含Amp的LB液体培养基中，220rm37℃液体培养，提质粒⑦用EcoRⅠ和HamHⅠ酶切步骤⑥中提取的质粒，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，然后用凝胶回收试剂盒回收目的基因。⑧用HamHⅠ酶切载体EQ（37℃，6h左右）酶切后上样loadingbuffer进行凝胶电泳切下目的载体条带，用凝胶回收试剂盒回收酶切后的载体，记为PGBKT7EBQ。⑨连接：将步骤⑦中回收的DNA片段与PGBKT7EBQ通过T4DNA连接。⑩筛选转化子，将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞涂布含Kna的LB平板，37℃过夜。⑪对大肠杆菌转化子进行鉴定，阳性转化子可用于转化酵母感受态细胞。三、判断题1.SDS的中文名称是十二烷基硫酸钾。（×）2.PCR反应中，经历高温变性、中温退火、低温延伸三个阶段。（×）3.DNA连接酶和DNA聚合酶相同点是都能连接磷酸二酯键。（√）4.大肠杆菌质粒DNA提取实验中，加入溶液2后，冰上保温30min。（×）5.制作DNA琼脂糖凝胶时，应加入1µl核酸染液。（√）6.质粒DNA的提取实验中，溶液1中的葡萄糖可以用水替代。（×）7.真核生物的基因组DNA可以用碱抽提。（×）8.大肠杆菌感受态细胞的制备实验中，两次加入Calc2的作用是一样的。（×）9.胰RNA酶的作用是保存RNA的。（×）10.DNA变性是双链氢键打开，而不是磷酸二酯键断裂。（√）11.在质粒DNA的转化实验中，涂平板后，应立即将培养皿放入恒温培养箱。（×）12.PUB-18质粒电泳为3条带