浊漳河水体有机污染物对人外周血淋巴细胞遗传毒性研究

浊漳河水体有机污染物对人外周血淋巴细胞遗传毒性研究

根据流行病学研究，饮用水中的有机污染与某些肿瘤的发生有关。自从20世纪70年代Rook和Bellar等在饮用水中发现氯仿等含氯碳氢化合物以来,已有大量研究报道了有关进入水体的污染物大多数是存在致突变性的有机污染物。浊漳河是流经山西省长治市的主要河流,是长治市12个县(市)区工农业及生活用水的主要来源之一,因此,查明浊漳河水体有机物污染状况对加强水质管理,保障人民健康具有重要意义。本文应用人外周血淋巴细胞彗星试验,对浊漳河水体中有机污染物的遗传毒性进行了研究,以期为水体安全监测提供快速、有效的测试方法和指标。1材料和方法1.1材料表面1.1.1血液样本1.2颗粒悬液的提取和富集在长治市浊漳河流域设置了3个采样点,分别为石子河暴马样点、浊漳南源黄碾样点、主干流石梁样点,于2011年3月从每个样点采集水样各20L。静置24h后,过滤去除悬浮颗粒。采用AmberliteXAD-2(Sigma)树脂吸附柱富集,控制流速在30~40ml/min。N2排除水分,以甲醇、丙酮、二氯甲烷各50ml洗脱,洗脱液用氮吹仪在50℃下浓缩、吹干,再用二甲基亚砜(DMSO)溶解,定容至20ml(即水样有机浓集物),4℃下避光保存,备用。1.3测试方法1.3.1巴细胞层不同浓度的染色人外周血淋巴细胞分离与染毒参照文献的方法。将2ml新鲜肝素抗凝血加入5ml新配制的3%的明胶中混匀,垂直浸入37℃水浴中,自然沉降约30min。吸取淡黄色淋巴细胞层0.2ml于预先装有0.8mlPBS缓冲液的微量离心管中混匀,3000r/m离心5min,弃上清,加入0.9mlPBS及0.1ml水样浓集物,4℃冰箱中染毒1h。每个水样设3个剂量:20、100、500ml/ml,即1ml暴露液相当于原水样20、100、500ml。染毒后3000r/m离心5min,弃去上清,沉积细胞置4℃冰箱中备用。同时分别以DMSO、H2O2溶液(10mmol/L)做为阴、阳性对照。并用TrypanBlue染色测定细胞存活率。1.3.2星测试2结果2.1染毒剂量对实验结果的影响各水样中有机提取物对人外周血淋巴细胞的影响即彗星试验结果见图1和表1,从图1中可见,阴性对照组细胞大小均一,呈圆形荧光团,无拖尾现象(图1A),提示DNA链未发生明显断裂。图1B~J可看出受损细胞DNA均出现明显彗星样拖尾,表明DNA链受损发生断裂,且随着受试物浓度增加损伤逐渐加重;高剂量组(每管100、500ml)中尾部荧光强度增强,彗星头部直径随着尾部的加长而减小;每管500ml剂量组细胞DNA损伤最为严重,图像表现为荧光信号变小,尾部长且尾部面积大(图1H~J)。如表1所示,各染毒剂量组DNA损伤指标均高于阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.01)。随着染毒剂量的增加,DNA损伤各指标呈现加重的趋势。以每管100ml这一剂量组进行多重比较表明,各样点水样对人血淋巴细胞DNA损伤程度从大到小依次为暴马>黄碾>石梁。2.2石梁水样中dna损伤程度不同水样、不同剂量有机提取物对人外周血淋巴细胞DNA的损伤分级如表2所示。表2显示,3个采样点的水样有机提取物均能引起不同程度的DNA损伤,经统计学检验,各剂量组DNA损伤程度(AU)与阴性对照组之间差异具有统计学意义(P<0.01)。在阴性对照组中,未损伤细胞为57%,有43%的细胞受到损伤,也集中在1级(低度损伤);随着水样剂量的加大,细胞受损程度逐渐加重,向2、3级损伤集中,在阳性对照组中,3、4级损伤占受损细胞的67%。以每管100ml剂量组进行多重比较发现,暴马水样与黄碾水样引起的DNA损伤程度为暴马大于黄碾,但二者间未见显著性差异(P>0.05),同剂量组石梁水样AU值暴马和黄碾相比具有统计学意义(P<0.05)。从表2还可看出,即使在低剂量下(每管20ml),细胞DNA损伤程度最小值为111.10,损伤率也达到55.6%,比阴性对照组显著升高,这意味着人血外周淋巴细胞对水体中有机污染物的毒作用非常敏感;最高剂量组(每管500ml)染毒条件下DNA损伤最为严重,损伤程度接近阳性对照水平。3常用的水环境监测材料自1988年Singh等提出在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法以来,目前已被广泛应用于放射生物学、遗传毒理学、DNA修复、细胞凋亡、肿瘤细胞治疗评价、环境生物监测、人群监测等诸多领域的研究。用于彗星试验研究DNA损伤的细胞有许多种,如肝脏细胞、各种肿瘤细胞、淋巴细胞等。其中,淋巴细胞具有易于采集、对机体损伤小、可用于活体检测等优点而被广泛采用。Rajaguru、厉以强、王伟琴、李兆利等将人外周血淋巴细胞应用于地表水和水源水的检测,表明其在水环境监测中有良好的应用前景。彗星试验具有诸多优点,试验数据来自单个细胞,仅需少量细胞,几乎所有种类的真核细胞都可以使用,方法敏感、简单且费用合理,数小时便可获得结果。作为一个单核细胞试验,其独特的优点在于:它能在一群混合细胞中测出非一致性反应。本实验中采用该方法成功的检测出浊漳河水体3个代表性采样点的水体中有机污染物的遗传毒性。但其对浊漳河水体有机污染物检测的试验程序尚未标准化,方法和结果观察也需进一步完善,有必要在今后的研究中加强方法学研究,摸索出适合浊漳河水体有机污染物检测的试验程序后进行推广应用。本研究对保护长治地区的水环境,优化当地人民生存环境,促进水环境质量可持续发展具有重要意义。1.1.2细胞平台电泳彗星试验采用经改良的Singh等的方法和OxiSelectTMCometAssayKit进行。将OxiSelectTMCometAgarose在90~95℃下水浴20min,使其液化,再置于37℃水浴中待用。每个微量离心管加600μl,与沉积细胞(已染毒)混匀后在彗星试验专用载玻片(3-WellCometSlides)上铺胶。每孔50μl细胞悬液,每个剂量3个平行;4℃下固化10min后,加入冷的细胞裂解液于4℃下裂解1h;然后置于碱性电泳缓冲液中,4℃下解旋20min。10V、80mA条件下电泳40min后在4℃下用冷的PBS缓冲液中和3次,每次5min;用VistaGreenDNADye染色,每孔50µl,10min后即可在荧光显微镜下观察并进行损伤评价和分析。1.4组间的多重比较1个典型彗星包括头部和尾部,根据拖尾中DNA的量占总DNA的比例,将DNA损伤程度分为5级:0级无损伤(正常细胞),<5%;1级低度损伤,≥5%~20%;2级中度损伤,≥20%~40%;3级高度损伤,≥40%~95%;4级重度损伤,≥95%。荧光显微镜下,每张玻片观察100个左右细胞,彗星图像用CASP软件自动分析,以彗星尾部DNA含量(percentageoftailDNA,TD)、彗星尾长(taillength,TL)、尾矩(tailmoment,TM)和Olive尾矩(Olivetailmoment,OTM)综合评价细胞DNA损伤情况,并计算细胞损伤专用单位(arbitraryunits,AU),方法如下:式中,i为损伤等级(0,1,2,3,4);Ni为i级的细胞数。数据均用表示,采用SPSS17.0统计软件处理,单因素方差分析(ANOVA)比较各剂量组与阴性对照组间的损伤差异。考虑到高剂量的染毒可能造成DNA严重损伤,从而使大量的游离DNA断片在电泳过程中丢失而引起可测DNA损伤的降低,而剂量过低可能使组间差异难以充分表现,所以本文以每管100ml这一剂量对各水样间的遗传毒性进行多重比较。组间的多重比较采用Duncan检验法,以α=0.05为检验水准。近年来,环境水样中的有机污染物日渐增加,对人类的生存构成严重威胁。水样中的有机污染物在水中存在的时间长,危害大。在美国环保局(EnviromentalProtectionAgency,EPA)列出的水中优先考虑的129种污染物中,有机污染物就占114种,多数为致突变物和致癌物。随着人们对生活质量认识的不断提高,对环境水样中有机污染物的重视程度不断加大,对环境水样有机物污染物的检测方法也受到极大地关注。本研究中,采用人外周血淋巴细胞彗星实验对浊漳河水体中的有机提取物的遗传毒性进行了评价。实验结果显示,浊漳河水体的3个代表性采样点(暴马、黄碾、石梁)的有机提取物具有遗传毒性,均可造成人外周血淋巴细胞DNA不同程度的损伤,表明浊漳河水体中含有诱变物质。因此,必须加强当地排污企业和生活污水的监督监测,找出可能的污染源并进行跟踪监测,以便了解其变化规律,从而为环境风险事故防范和应急预案的建立提供依据。本次实验中,3个采样点的有机提取物在所设计的剂量范围内均能引起DNA损伤,在低剂量范围内彗星尾长与DNA损伤程度呈线性关系,但在每管500ml剂量组尾长增加不明显甚至有所降低(表1)。此时,尾部的DNA荧光强度与损伤程度的关系更为密切,尾矩(TM)是尾部DNA百分含量与头、尾部中心间距的乘积,在本实验条件下,高剂量组尾矩与损伤程度仍保持较好的线性关系,故该参数能较满意地用于DNA损伤评价分析。石梁水样500ml剂量组的Olive尾矩与100ml剂量组相比略有下降,是因为该水样引起少量DNA4级重度损伤(3.64%)。Olive等通过对人血淋巴细胞的研究认为,高剂量暴露可导致细胞电泳过程中DNA断片大量流失,从而导致高剂量组的可见DNA损伤降低。细胞损伤专用单位(AU)是一种衡量DNA链断裂损伤程度的特有单位,根据DNA损伤程度进行分级并加以换算统计,从而得到DNA损伤的总体水平。因此,本试验中以100ml剂量组进行多重比较,3个采样点的DNA损伤程度从大到小依次为暴马>黄碾>石梁。水体中有机污染物的来源与点源污染密切相关。暴马断面主要接纳长治市区部分工业废水和生活污水,水质类别为劣Ⅴ类;黄碾断面位于郊区工业园区,废水多为化工、冶金、焦化等行业废水;石梁位于浊漳河三支流汇合的干流上,虽然受到上游某大型化肥厂和造纸厂排污影响,但由于水量增大,水体的自净能力对工业废水具有明显的稀释作用。同期监测3个采样点的综合污染指数分别为:暴马10.78,黄碾5.74,石梁1.24,结果与本研究中的彗星试验相吻合。健康人外周肝素抗凝全血,由长治市中心血站提供。主要