茶树多酚氧化酶基因分型的sscp分析

茶树多酚氧化酶基因分型的sscp分析

根据人类科学研究的大量遗传信息，人类血浆培养序列的突变与遗传形态直接相关。根据人类育种计划产生的大量遗传信息，人类疾病的来源是相关基因的单态突变。多酚氧化酶（ppo）在茶叶加工中发挥着非常重要的作用。其活性也是决定茶类适应性的重要指标。不同品种的ppo活性的差异必须与ppo基因的突变密切相关。作者首次研究了不同茶类优质基因的snov，这是为了进一步探索与ppo活性不同的dna突变，这对茶类新品种的改良中茶类适应性的早期鉴定非常重要。这为茶类资源的分子特征提供了理论和实践的指导。1材料和方法1.1供试材料40个茶树品种(系)分别采自广东省农业科学院茶叶研究所、湖南郴州茶树良种繁殖示范场:苹云,槠叶齐,福鼎大毫,云南大叶,广西78-2,龙井43,黔湄809,长叶白毫,白毛2号,潮安大乌叶,祁门4号,金观音,英红9号,黄叶水仙,福鼎大白茶,八仙茶,云南红芽,优18号,优19号,优17号,优20号,优15号,印6号,印5号,斯2号,斯1号,白毫早,佛手,茗丰,高桥早,福毫,福云6号,梅占,东湖早,政和大白茶,毛蟹,不知春,碧香早,迎霜,乌牛早.供试材料于-70℃冰箱中保存.1.2方法1.2.1sscp分析根据文献公布的cDNA序列(设为对照),采用Genetool软件设计引物.依PCR-SSCP对SNP分析要求DNA序列长度为200bp左右的特点,共设计5对引物(表1),交上海生物工程公司合成.25µLPCR反应体系包括100ng基因组DNA,1×PCRbuffer,0.5µmol/L正、反向引物,0.15mmol/LdNTPs,1.5mmol/LMgCl2,1UTaqDNApolymerase(所有试剂从晶美生物工程公司购买).PCR反应条件为:94℃预变性4min,94℃变性40s,最佳退火温度退火50s,72℃延伸1min,32个循环,最后于72℃延伸7min.PCR产物采用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行SSCP分析,对不同供试材料作初步基因分型[7,8,9,10,11,12,13].1.2.2序列比和测序通过反双类分析测序对PCR-SSCP分析所区分的不同基因型分别挑选有代表性的品种(系),再作PCR扩增,将扩增产物送博亚生物技术公司进行正反双向测序.采用DNASTARProgram,将测序序列与对照序列进行同源性比较,搜寻SNP和导致酶切位点变异的SNP及导致氨基酸变异的SNP.对序列比对发现的SNPs位点再重复测序1次,以提高结果的准确性.2结果与分析2.1多态性引物扩增片段的sscp分析采用优化建立的PCR-SSCP-银染分析技术,对供试材料PPO基因的单链构象多态性进行检测的结果表明,不同品种之间存在丰富的单链构象多态性.其中在引物3～5扩增区段的多态性比保守序列区(第1～2引物扩增区段)的丰富.图1是引物1扩增片段的SSCP分析结果,20个供试材料在此引物扩增区段被明显区分为3种不同的带型.2.2广西snps位点对根据PCR-SSCP分型分析所选定的品种(系)进行扩增并测序,通过与CK序列作同源性比较后,从各引物扩增片段中搜寻到的SNPs列于表2.在引物1扩增区段有3个SNPs位点,其中优20号在第31位有A→G的转换;第63位八仙茶有G→C的颠换,优17号、迎霜在此位点均为杂合子(G/C);第64位政和大白茶为杂合子(C/T).在引物2扩增区段有5个SNPs位点,其中第21位优20号、优15号、东湖早为杂合子(A/G);第85位优15号为杂合子(A/G);槠叶齐在第131位有C→T的转换;优20号、印6号在此位点为杂合子(C/T);第141位优20号、印6号、东湖早均为杂合子(G/A);第152位不知春有C→T的转换,政和大白茶为杂合子(C/T).在引物3扩增区段有7个SNPs位点,其中印5号在第31位有G→T的颠换,优18号为杂合子;第42位金观音、八仙茶为杂合子(C/T);第74位优18号为杂合子(A/G);第77位八仙茶为杂合子(G/T);第128位印5号有T→A的颠换,优18号、优20号为杂合子(T/A);第133位八仙茶为杂合子(G/T);135位金观音、八仙茶、优18号均为杂合子(C/T).在引物4扩增区段有8个SNPs位点,其中迎霜在第34位为杂合子(A/G);第56位八仙茶有C→T的转换,福鼎大白茶、福云6号、毛蟹、迎霜为杂合子(C/T);第59位八仙茶为杂合子(G/A);第63位云南大叶、英红9号有G→T的颠换,苹云为杂合子(G/T);第64位毛蟹为杂合子(G/T);第73位优19号、毛蟹、迎霜均为杂合子(A/C);第91位福鼎大白茶、优19号、茗丰、毛蟹、迎霜均为杂合子(C/T);第110位福鼎大白茶、优19号有A→T的颠换,苹云、云南大叶、英红9号、黄叶水仙、茗丰、毛蟹均为杂合子(A/T).在引物5扩增区段有14个SNPs位点,其中第22位政和大白茶为杂合子(C/T);第24位云南大叶有A→G的转换,广西78-2为杂合子(A/G);第31位不知春有C→T的转换;第33位云南大叶、广西78-2有T→C的转换;第42位祁门4号、不知春有G→A的转换;52位政和大白茶有C→G的颠换;第60位广西78-2为杂合子(A/T);第72位云南大叶为杂合子(C/T);第77位云南大叶、广西78-2、祁门4号、优20号、不知春有G→T的颠换,东湖早、政和大白茶为杂合子(G/T);第83位政和大白茶为杂合子(T/C);第108位广西78-2为杂合子(T/C);第114位政和大白茶为杂合子(T/C);第174位优20号为杂合子(A/G);第184位广西78-2有A→G的转换.图2列举了DNA测序图谱中的2个SNPs位点.在引物3扩增区域的128位,金观音与印6号为T碱基(同CK),优18号为T碱基与A碱基的杂合子(以N表示),而印5号则为A碱基.在135位印6号与印5号为C碱基(同CK),而金观音与优18号为C碱基与T碱基的杂合子.在此扩增区域的128位至135位的8个碱基长度内有2个SNP位点,表明茶树PPO基因在此区段单核苷酸多态性丰富.2.3pcr扩增区域tavi酶切位点的消失在37个SNPs中,有13个位点导致了酶切位点的消失或产生(表3).如引物1扩增区域的第63位由于G→C的颠换,产生了1个新的核酸限制性内切酶酶切位点,该内切酶为BsuRⅠ.引物4扩增区域的56位原本有1个HpaⅡ酶切位点,由于C→T的转换,使该酶切位点消失.引物5扩增区域的第24位、42位、52位、174位均导致了TaqI酶切位点的消失,第72位导致了HpaⅡ酶切位点的消失.2.4各物4扩增区域不同突变量的比对在37个SNPs中,共有10个品种(系)在10个位点发生了氨基酸序列变异(表4),其中八仙茶在引物1与引物4扩增区域,各有1处错义突变,分别为丝氨酸突变为苏氨酸,丝氨酸突变为苯丙氨酸;不知春在引物2与引物5扩增区域,也各有1处错义突变,分别为精氨酸突变为半胱氨酸,脯氨酸突变为丝氨酸.其他因单核苷酸变异而导致氨基酸变异的品种(系)还有槠叶齐、印5号、云南大叶、英红9号、福鼎大白茶、优19号、政和大白茶、广西78-2.3品种系的基因型及杂合子和基因型分析本研究以在GenBank中公布的茶树PPO基因的部分序列为模板,从序列的54位至902位设计5对最适引物,共跨越849个碱基,在不同引物扩增区域分别选择经PCR-SSCP分型分析筛选后的品种(系)测序,经同源性比较的结果表明,在茶树PPO基因中,不同品种之间存在丰富的SNP.共发现SNP位点37个,即平均每23个碱基就有1个SNP.从第1至第5扩增区段SNP的出现频率分别为1.68%,2.82%,3.22%,4.10%,6.08%.很显然,在PPO基因保守序列存在的第1～2区段,SNP出现的频率较低.在茶树PPO基因中出现如此高频率的SNP应该与茶树长期异花授粉导致的高度异质性相关,同时所选试验材料囊括了不同生态群的40个品种(系),其遗传背景十分复杂,且PPO活性差异悬殊.SNP常表现为核苷酸的转换、颠换、插入和缺失,但通常所指的SNP不包括后两种情况.因此,SNP主要有嘌呤与嘌呤或嘧啶与嘧啶之间的转换类型(包括C↔T,A↔G)及嘌呤与嘧啶之间的颠换类型(包括A↔C,A↔T,G↔C,G↔T).由于核苷酸的5-甲基胞嘧啶脱氨基反应相对比较频繁,使各类SNP在基因组中出现的频率不同,通常生物体中约2/3是转换类型.发现的37个SNPs中,转换变异为10个,源于试验品种(系)的亲本之一有转换变异的杂合子(如C/T,A/G)为10个,二者共计25个,占67.57%;颠换变异为7个,源于试验品种(系)的亲本之一有颠换变异的杂合子(如G/T,A/T,A/C,G/C)为5个,二者共计12个,占32.43%.这与通常生物体基因组中SNP的发生约2/3为转换变异相符合.本研究发现的转换类型包括A↔G,C↔T,颠换类型包括A↔T,G↔C,G→T,A→C.在基因的编码序列中,SNP大多位于密码子的摇摆位置,表现为沉默突变.发现的37个SNPs中,有10个位点为错义突变导致氨基酸的改变,占SNP总数的27.03%.在新等位基因分析时,依据GenBank中同一基因的氨基酸序列,若基因中的核苷酸变异引起了新的氨基酸产生,即认为是1个新的等位基因.本研究的结果表明,茶树PPO基因有许多等位基因.茶树品种存在明显的茶类适制特性,有的品种由于其PPO活性高,制红茶品质好,而有的品种只能制绿茶,若制红茶,则难于发酵.不同茶树品种之间所表现出的各不相同的PPO活性,应该与PPO基因存在丰富的等位基因有关.理论上,在一个二倍体生物群体中,SNP可以由双等位、三等位或四等位基因构成,但实际上三等位或