银杏酚液剂的研制及其生物活性

银杏酚液剂的研制及其生物活性

蔬菜是十字花科植物的主要害虫之一。长期以来，对青蔬菜的防治主要依靠大量的化学农药的使用，蔬菜生产的r问题（害虫有抗药性，害虫猖獗，农药残留）日益严重。近年来,人们开始研究开发无公害农药代替化学农药防治害虫,尤其对开发和利用植物次生化合物防治害虫,逐渐受到人们的重视。在漫长的昆虫与植物的协同进化过程中,植物形成了许多防护机能。植物次生化合物就是植物的次级代谢产物,在植物与昆虫的协同进化中起着主导作用。银杏的次生代谢产物有银杏酮、银杏内酯、银杏酚、银杏酸等多种化合物,其中银杏酮、银杏内酯已被开发为治疗心脑血管疾病的药物。银杏酚、银杏酸是控制害虫作用的活性成分,具有防治农业害虫的作用,主要存在于叶和外种皮中。银杏外种皮中银杏酚含量较高,在15%以上。银杏酚是烃基酚,如13-烷基苯酚、15-烷基苯酚、15-烯基苯酚等。虽然一些文献报道了银杏酚酸类化合物具有防治菜青虫的作用,但是,目前还未见到关于测定银杏酚防治菜青虫的防治效果的报道。为了搞清楚银杏酚对菜青虫的防治效果和拒食活性,为利用银杏外种皮研制防治菜青虫的新型杀虫剂提供依据,本研究从银杏外种皮中提取银杏酚等提取物,进行了测定银杏酚对菜青虫拒食活性的研究。1实验1.1银杏外土的选择从邳州市炮车镇围北村的苏州青青菜地中采集菜青虫,挑选健康的,大小一致的三龄和四龄幼虫供试验,试验前饥饿5h。银杏外种皮购于邳州市国家银杏博览园,邳州市港上镇。荧光硅胶,规格G型,浙江雁荡山试剂厂。1.2方法1.2.1提取、浓缩、分离将银杏外种皮晒干、去杂、粉碎至粒径1mm,用水提取2次以去除糖类等水溶性无效物质,将提取液放掉或作他用。残留物质再用乙醇提取2次,过滤提取液,并将提取液蒸发、浓缩成膏状,得粗提取物。将粗提取物用硅胶薄层析板分离法提纯。溶剂为氯仿,展开剂为氯仿∶乙酸乙酯∶乙酸=90∶10∶1(体积比),洗脱剂为氯仿,分离出银杏酚含量较高的提取物,得精提物。1.2.2气相色谱条件委托南京大学现代分析中心对提取物进行定性/定量分析。检测设备为气质联用仪。气相色谱条件:DB-5毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm);气化温度250℃;柱温150℃;保持1min,然后以升温速率12℃/min升温至290℃。1.2.3银杏酚液剂的制备银杏酚是脂溶性化合物。将精提物溶于氯仿,加适量的对昆虫无影响的烷基酚聚氧乙烯醚乳化剂,制备含12.6%银杏酚的水溶性液剂,称作银杏酚液剂。1.2.4叶碟叶碟的制备用水为溶剂,把银杏酚液剂用梯度稀释法,分别稀释50、100、150、200倍4个浓度梯度。采用叶碟法,用打孔器(直径20mm),将新鲜的苏州青青菜的菜叶打成叶碟,放入稀释液浸5s取出,另设清水对照组,待叶碟干后,置于直径为9cm培养皿中,内垫滤纸加少量蒸馏水保湿。每皿6片,接入饥饿5h的试虫一头,5头为一重复,处理1～7天,分别用方格纸测定取食面积。每天测定后,换掉试虫取食后的残片,其余叶碟保留。拒食率按以下公式计算:拒食率=(对照组取食量-处理组取食量)/对照组取食量×100%2结果与分析2.1五烷基苯酚气质分析结果表明:精提物含十六酸乙酯0.82%;十八烯酸乙酯1.16%;十三烷基苯酚12.18%;十五烯基苯酚65.03%;十五烷基苯酚17.58%;十五烷基间二苯酚0.01%;二十九烯-140.97%。其中银杏酚,如十三烷基苯酚,十五烷基苯酚,十五烯基苯酚等含量为94.80%。2.2拒食率及拒食速率从表1～表2中可以看出,银杏酚对菜青虫三、四龄幼虫有明显拒食作用。对三龄幼虫拒食率在30.1%～81.5%,处理1天后,拒食率较低,处理2天后,200倍稀释液对三龄幼虫拒食率达77.4%。对四龄幼虫拒食率在31.9%～85.3%。50倍和150倍稀释液,处理5天后,拒食率分别上升至70.0%和74.0%。200倍稀释液拒食作用较差,处理4天以后,三龄、四龄幼虫拒食率分别下降至30%和40%左右。总起来看,银杏酚液剂稀释150倍以下,对菜青虫拒食作用较大,对三龄幼虫优于对四龄幼虫的拒食作用。2.3稀释液处理对四龄幼虫的效果在进行银杏酚对菜青虫三龄、四龄幼虫拒食活性测定的同时,还对试虫的死亡和变蛹情况进行了观察和统计:三龄幼虫的清水对照组,喂饲11～12天全部变蛹。用银杏酚液剂100、150倍稀释液处理的三龄幼虫全部死亡。200倍稀释液处理的三龄幼虫,约20%变蛹,80%死亡。四龄幼虫清水对照组,喂饲6～7天全部变蛹,用50、100、150倍稀释液处理的四龄幼虫,除个别变蛹外,其余死亡;200倍稀释液处理四龄幼虫,约40%变蛹,60%死亡。50倍稀释液处理四龄幼虫,死亡时间为处理后5～7天。其余稀释液处理的幼虫,全部发育为超龄幼虫,超龄2～16天后死亡或变蛹。因多数试虫死亡时间是在发育成超龄幼虫后,即使50倍稀释液处理的四龄幼虫,死亡时间也是在清水对照组的变蛹期,所以试虫死亡对于减少菜青虫对蔬菜危害意义不大了,但可以大大减少幼虫发育成蛹的数量,对预防菜青虫再次发生具有控制作用。2.4银杏酚抑制酶系统成分酶活性银杏酚是烷基酚类化合物。对于烷基酚类化合物的生物活性的研究工作,国外开展的较早,主要是研究腰果壳中的烷基酚化合物(银杏外种皮大部分烷基酚类化合物与腰果壳中的相同)并发现它们具有多种生物活性。它们是某些重要酶的抑制剂,如烷基酚是酪氨酸酶、15-脂肪氧合酶、磷脂酶CγI、丙三醇-3-磷酸盐脱氢酶等酶的抑制剂。Isaokubo报道了漆酚酸可抑制昆虫前胸腺合成酶的活性。漆酚酸是13碳～17碳烷基酚类或烷基酚酸类化合物。前胸腺合成的激素为蜕皮激素。蜕皮激素主要作用外胚层来源的真皮组织,如真皮细胞、器官芽细胞或神经系统消化道等相应的内部器官。蜕皮激素刺激真皮细胞,细胞核内染色体某些部位即出现“膨胀”,此标志DNA的螺旋被打开,将遗传密码转录子mRNA上,mRNA进入细胞质,将所携带的信息在那里用于合成特定的蛋白质,主要是酶的合成,如酪氨酸酶等,将使酪氨酸经一系列变化成为蜕皮后新表皮所需的硬化物质,表现为新表皮的生长与旧表皮脱去及虫体的长大。由于银杏酚抑制了酪氨酸酶的活性或抑制了酶合成,使酪氨酸不能发生一系列变化,不能生成蜕皮后新表皮所需的硬化物质,影响了试虫的正常蜕皮和生长发育,使试虫表现为拒食和发育为超龄幼虫,甚至不能形成蛹而致死。如今对昆虫的一些激素及其类似物已在若干重要害虫(如二化螟、库蚊、体虱、丽蝇、黄粉蝶和蚜等)中广泛地进行了实验,并取得了一定的控制效果,因而有些人主张用昆虫激素或动植物中提取的同功物质,试图阻止昆虫正常生长发育或致其死亡。此工作受到各国的重视,并以此作为发展新型杀虫剂的一个新方向,称其为第三代新型杀虫剂。3银杏酚防治菜青虫3.1银杏酚对菜青虫具有明显的拒食活性。银杏酚对菜青虫的防治作用,是以拒食作用和驱虫作用为主的,稀释液中银杏酚含量越高,防治时间越早,防治效果越好。3.2由于银杏酚抑制了酪氨酸酶的合成或活性,影响了菜青虫的正常蜕皮和生长发育,使其发育为超龄幼虫,超龄2～16天,致使在进行银杏酚防治菜青虫田间药效试验时,发现菜青虫死亡