杜仲叶功能组分的分离与鉴定

杜仲叶功能组分的分离与鉴定

杜仲是中国传统的稀有中药，其药用价值一直受到人们的关注。现代医学研究证实杜仲叶与皮的化学成分基本一致,具有同等功效,特别是其绿原酸和黄酮的含量远高于皮中的含量[1~3],因此分离与鉴定杜仲叶的功能因子研究具有一定的应用价值。黄酮类化合物是一类在植物界中分布广泛且重要的多酚类天然产物,具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、降血脂、治疗心血管疾病等生物活性。有研究表明,杜仲黄酮的主要成分为槲皮素和槲皮苷等[4~6]。MucsiI等人研究发现槲皮素、槲皮苷、芦丁和橙皮苷等黄酮类化合物通过刺激AMP的合成而达到抑制疱疹病毒活性的目的,尤其以槲皮素和槲皮苷的抑制活性较为明显。目前已知的黄酮类化合物单体已超过8000种,可分为黄酮类、黄酮醇类、异黄酮、查耳酮、橙酮、花青素以及上述各类的二氢衍生物。将杜仲叶提取物进行分离纯化,所得黄酮类单体化合物经光谱鉴定,含有绿原酸、槲皮素、山柰酚、紫云英苷、异槲皮苷、芦丁、槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖甙、槲皮素-3-O-葡萄糖基-(1→2)-阿拉伯糖苷或槲皮素-3-O-木糖基-(1→2)-葡萄糖苷等物质。本文以杜仲叶为原料,采用乙醇超声波辅助水提法,经大孔树脂NKA-Ⅱ、聚酰胺SephadexLH-20树脂柱层析对粗提物逐一分离、纯化,从杜仲叶粗提物中分离得到4种精提物组分,然后通过薄层色谱(TLC)、紫外光谱(UV)、高效液相色谱(HPLC)和电喷雾电离源-质谱(ESI-MS)对精提物结构进行分析与鉴别,为杜仲叶活性成分的工业化生产提供科学依据。1材料和方法1.1药品、化学品试剂杜仲叶,浙江省开化县杜康茶业有限公司;NKA-Ⅱ树脂,西安蓝深特种树脂有限公司;聚酰胺粉(80~100目),国药集团化学试剂有限公司;SephadexLH-20,美国GE公司。芦丁标准品、绿原酸标准品,中国药品生物制品检定所;甲酸、甲醇(色谱纯),美国SIGMA-ALDRICH公司;无水乙醇、冰乙酸、正丁醇、三氯甲烷、石油醚、盐酸、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠均为分析纯;重蒸水。1.2设备与技术指标均有了新的发展空间超高效液相色谱分析系统(ACQUITY),配置ACQUITY自动进样器;高分辨四极杆与飞行时间串联质谱仪(Q-TOFPremier),美国WATERS公司;数据处理系统(MassLynx4.1),美国WATERS公司;超纯水系统,法国MILLIPORE公司;电脑全自动部份收集器(DBS-100)、紫外检测仪(HD-3)、电脑恒流泵(DHL-A)、电脑采集器(HD-A),上海沪西分析仪器厂有限公司;点样毛细管,上海申立玻璃仪器有限公司;硅胶板(GF254)5cm×15cm,上海信谊仪器厂;手提紫外检测灯(ZF-7型),上海顾村电光仪器厂;层析柱,上海厦美生化科技发展有限公司;超声清洗机(JP300型),武汉嘉鹏电子有限公司;旋转蒸发仪(HeidolphLaborota4000efficient);紫外-可见分光光度计(UNICOUV-2102PC型);万分之一电子天平(AL204),梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;真空冷冻干燥机(MODULYOD-230),THERMOELECTRON公司。1.3测试方法1.3.1杜仲叶中绿原酸、总黄酮的提取、分离和精制方法1.3.1.超声辅助提取法杜仲叶杀青(180℃)→摊晾→烘干(80~90℃)→粉碎→石油醚脱脂→70%乙醇超声波辅助水提→离心→取上清液浓缩→冷冻干燥→杜仲叶粗提物。1.3.1.洗脱部分的分离纯化取600g杜仲叶粗提物,用大孔树脂NKA-Ⅱ(玻璃层析柱7.6cm×70cm)分离,水(18L)、30%乙醇(9L)、50%乙醇(15L)、70%乙醇(12L)、90%乙醇(3L)依次洗脱。经化学反应、薄层层析和HPLC检测,30%洗脱部分的主要成分是绿原酸类物质,70%洗脱部分的主要成分是黄酮类物质,故选择30%和70%洗脱部分进行分离纯化。称取25g30%洗脱部分,经聚酰胺柱(80~100目)分离,乙醇-水(0%、10%、20%、30%、40%)梯度洗脱,Fr21~70经SephadexLH-20纯化,收集白色晶体组分Ⅰ。称取25g70%洗脱部分,经聚酰胺柱(80~100目)分离,乙醇-水(0%、30%、40%、50%、60%、70%、90%)梯度洗脱,Fr27~73、Fr105~150、Fr295~315分别经SephadexLH-20纯化,得黄色晶体组分Ⅱ、组分III、组分Ⅳ,分析这4种精提物组分(Ⅰ、Ⅱ、III和Ⅳ)。1.3.2展开剂为5种多素类似物的标准品与杜仲叶粗提物的筛选干燥器中的薄层板使用前需在100℃烘箱中活化1h。由于黄酮类分子中含有酚羟基,酸性展开剂有利于分离,因此在展开剂中加入少量的乙酸,以改善拖尾,实现更佳的分离效果。本试验中使用的展开剂为V(正丁醇)∶V(水)∶V(乙酸)=50∶50∶0.1,充分摇匀,静置后取上层液备用。采用绿原酸、牡荆素、芦丁、杨梅素、槲皮素、木犀草素和山柰酚7种标准品与杜仲叶粗提物进行对照分析,结果发现本试验的杜仲叶粗提物中绿原酸、芦丁、槲皮素3种类似物含量较多。于是选用绿原酸、芦丁、槲皮素的标准品及杜仲叶的4种精提物组分进行分析。将它们的乙醇溶液点样于薄层板上,展开剂分离后喷入AlCl3显色剂,得薄层图谱,再置紫外灯(365nm)下检测,计算R值。Rf值计算公式:Rf=溶质斑点中心的移动距离/溶剂前沿移动的距离1.3.3杜仲叶精提物的紫外吸收光谱图将杜仲叶的精提物粉末及绿原酸和槲皮素标品分别用无水甲醇溶解,以无水甲醇为参比,用紫外-可见分光光度计在波长200~400nm范围扫描,得到杜仲叶精提物和两种标样的紫外吸收光谱图,进行对照分析。1.3.4hplc-ms法1)对照溶液的制备:分别精密称取绿原酸、牡荆素、芦丁、杨梅素、槲皮素、木犀草素和山柰酚7种对照品,用甲醇溶解,等体积混合,制成一定浓度的7种混合标准品溶液(作为对照液),然后用0.25um的微孔滤膜过滤,置于-20℃冰箱备用。2)供试品溶液的制备:准确称取杜仲叶精提物,其中组分Ⅰ0.0027g、组分Ⅱ0.0019g、组分II-I0.0018g、组分Ⅳ0.0016g,置于10mL容量瓶中,用无水甲醇(色谱纯)溶解,定容至刻度,摇匀,然后用0.25μm微孔滤膜过滤,置于-20℃冰箱中,待HPLC和ESI-MS检测。3)色谱条件:色谱柱:ACQUITYUPLCBEHC18(100mm×2.1mm,1.7m),美国WATERS公司;柱温25℃;流速0.35mL/min;检测波长365nm;进样量5uL;流动相采用梯度洗脱方式:流动相A为水+0.1%甲酸,B为甲醇+0.1%甲酸,0~0.3min,A与B体积比90∶10;0.3~10min,A与B体积比5∶95;10~10.5min,A与B体积比0∶100。4)质谱条件:电喷雾质谱(ESI-MS)法,负离子模式;离子源温度125℃;去溶剂温度250℃;脱溶剂气流量400L/h;锥孔气流量50L/h;毛细管电压2.5kV,锥孔电压50V;质谱扫描范围100~1200m/z。2结果与分析2.1组成中的成分及展开体系的稳定性分析药典方法中检测黄酮类成分的显色剂多为三氯化铝乙醇溶液。在中药分析中,与三氯化铝乙醇溶液反应呈色并产生荧光是黄酮类成分的特征鉴别方法。本试验中采用三氯化铝乙醇溶液为显色剂,检测到E、F、G3个斑点呈亮黄色并带有荧光,即黄酮类成分。图1中A、B、C分别为绿原酸、芦丁、槲皮素3种标准品,组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分别以字母D、E、F和G表示。如图所示,A、B、C3个斑点清晰,圆而集中,不拖尾,表明此展开体系对该类物质的薄层层析效果显著。结合紫外灯观察,杜仲叶精提物的4种组分均为单一斑点,表明4种组分的成分较单一。各组分的Rf值见表1,其中绿原酸、芦丁、槲皮素的Rf值分别为0.263、0.500、0.763;组分Ⅰ的Rf值为0.263,与绿原酸标品一致;组分Ⅳ的Rf值为0.737,与槲皮素标品接近;组分Ⅱ的Rf值为0.632,介于芦丁与槲皮素之间;组分Ⅲ的Rf值为0.211,说明组分Ⅲ在此弱极性展开体系中的极性较强,可能与其结构有关(可能含乙酰葡萄糖基)。通过比较分析,判定组分Ⅰ为绿原酸类物质,组分Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ为黄酮类化合物。2.2黄酮与黄酮醇的紫外光谱特征称取分离纯化后的杜仲叶精提物粉末组分Ⅰ0.0027g、组分Ⅱ0.0019g、组分III0.0018g、组分Ⅳ0.0016g,用无水甲醇溶解、定容至10mL,摇匀。以无水甲醇为参比,进行紫外扫描,紫外光谱图见图2。从图2a可以看出,对组分Ⅰ的波长扫描结果与绿原酸标准品相似,组分Ⅰ在波长200~400nm范围的最大吸收波长是324nm,绿原酸标准品的最大吸收波长是330nm,两者最大吸收波长存在差异,其原因有待查。黄酮和黄酮醇的紫外光谱在波长220~400范围有2个吸收带。将处于300~400nm区域的吸收带称为带Ⅰ,将处于220~280nm区域的吸收带称为带Ⅱ。黄酮的分子由2个生色团组成,即A环的苯甲酰基和B环的肉桂酰基,二者互相影响。带Ⅰ主要与肉桂酰基生色团有关,带Ⅱ与甲苯酰基生色团有关。如图2b、2c、2d所示,杜仲叶精提物组分Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ在甲醇中的紫外吸收光谱符合黄酮和黄酮醇的紫外光谱特征。另外,根据MeOH谱的峰形,可初步判断化合物的母核结构。当带Ⅰ和带Ⅱ峰强相似,且均为主峰时,多为黄酮、黄酮醇或其苷类物质。当带Ⅰ>350nm,则多为黄酮醇或其苷类。从表2可以看出,杜仲叶精提物中组分Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的甲醇溶液在波长220~280nm范围有带Ⅱ吸收峰,说明这3个组分均含有A环-苯甲酰基团,且3个组分的带ⅡUVmax与槲皮素的带ⅡU-Vmax255nm相近,表明A环的C-5,7可能被羟基(-OH)取代。另外根据黄酮类化合物的羟基取代位置对其紫外光谱影响的结果对照,进一步验证了该推断的成立。同样,3组分的甲醇溶液在300~400nm处有带Ⅰ吸收峰,说明3组分均含有B环-肉桂酰基团。组分Ⅳ与槲皮素在波长367nm处有大吸收峰,符合黄酮醇类化合物在C环C-3有羟基(-OH)取代的紫外光谱特征。另外,组分Ⅱ和组分Ⅲ的带ⅠUVmax相比槲皮素的带ⅠUVmax367nm分别紫移动了18nm和22nm,说明可能存在3-OH的糖苷化。总之,组分Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ具有黄酮类化合物C6-C3-C6的基本母体骨架,其中组分Ⅱ、Ⅲ可能属黄酮苷类,组分Ⅳ可能是槲皮素。为了验证这一推断,需分析色谱和质谱结果。2.3组分的质谱特征对7种标准品混合液及杜仲叶精提物的4个组分,分别进行HPLC和ESI-MS分析,试验结果如图3~图7所示。图3显示,绿原酸标品的出峰时间为2.65min,图3b中出现m/z=353.08,为绿原酸的准分子离子[M-H]-。其中,m/z=191的碎片为1,3,4,5-四羟基环己烷羧酸特征基团,是从单个绿原酸分子上断裂形成的;而m/z为707.18和1061.29的质谱峰分别是绿原酸的二聚体(相对分子质量708)和绿原酸三聚体(相对分子质量1062)的准分子离子。槲皮素标准品的出峰时间为5.73min,由图3c推测m/z=301.03的质谱峰是槲皮素标准品的准分子离子[M-H]-。组分Ⅰ为浅绿色粉末,图4中的紫外检测图谱显示其出峰时间为2.66min,与绿原酸标准品的出峰时间相近。组分Ⅰ的质谱图中也出现m/z=353.08的准分子离子[M-H]-和m/z=191.07的碎片以及m/z=707.18的二聚体,与绿原酸标准品的质谱峰一致,故组分Ⅰ为绿原酸。所有样品的检测条件相同,根据绿原酸的质谱图解析模式对组分Ⅱ进行分析。图5显示,m/z分别为463.09和927.18的质谱峰可能是组分Ⅱ的准分子离子[M-H]-和二聚体分子离子[2M-H]-,而m/z=301.03的质谱峰是组分Ⅱ的准分子离子去掉1个六碳糖基的离子峰[M-H-162]-。图5也证实了m/z=162.89的碎片存在。根据文献[10-11,16]推测组分Ⅱ的相对分子质量为464,推测可能是金丝桃苷或陆地锦苷。由图6可以推测组分Ⅲ的准分子离子峰[M-H]-是m/z=505.09的质谱峰。另外,根据后期的红外光谱检测和一级核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)图谱推断m/z=300.02的质谱峰很可能是组分Ⅲ去掉1个m/z=204的乙酰葡萄糖苷基团而得到的离子峰[M-H-204]-。根据紫外光谱特征及黄酮体化合物鉴定手册,推测组分Ⅲ可能是槲皮素-3-乙酰葡萄糖苷,需进行验证。图7显示组分Ⅳ的出峰时间为5.73min,与槲皮素标准品的出峰时间相同,质谱图中也出现m/z=301.03的准分子离子峰[M-H]-和m/z=603.07组分Ⅳ的二聚体[2M-H]-,与槲皮素标准品的质谱图一致,故组分Ⅳ为槲皮素,其纯度高于96%。对于4种杜仲叶精提物组分的化学结构式有待下一阶段的核磁共