24学时细胞生物学实验及研究法指导

细胞生物学实验实验一不同显微镜的使用及细胞一般形态结构的观测[实验目的]通过本实验，使学生巩固普通光学显微镜的使用，学习相差显微镜、暗视野显微镜和荧光显微镜的使用方法，学习显微测量及显微摄影的操作方法，增强对细胞的形态和真实大小的感性认识。通过本实验操作，要求学生掌握细胞形态结构的基本观测方法与技术，为进一步的细胞生物学研究打好基础。[实验原理]应用显微镜的成像原理(详见翟中和等主编《细胞生物学》，第三章第一节)，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，观察细胞形态，得出细胞的大小。该实验完成需时6学时。[实验材料、试剂和仪器]一、仪器普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、显微拍摄系统、37℃二、材料洋葱根尖切片标本，念珠藻永久装片，兔肝细胞标本，夹竹桃花丝毛细胞，人口腔上皮细胞等。三、试剂生理盐水，10µg/mL罗丹明123染液（溶于甲醇，避光于4℃保存[实验步骤]一、暗视野显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生理盐水中，盖上盖玻片，略微压片，用滤纸条吸去盖玻片四周多余的水分。2、将上述装片置于显微镜载物台上，在10×物镜下找到夹竹桃花丝毛细胞清晰的图像。3、换上暗视野聚光器，调节至最佳位置，通过聚光器上的调中螺旋调节聚光器的中心位置，得到最好的暗视野图像效果。4、观察夹竹桃花丝毛细胞内部的显微结构和细胞质环流现象，并拍照。5、换用高倍物镜观察时，要换用与高倍镜相匹配的暗视野聚光器，重复以上调节步骤。二、相差显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生理盐水中，盖上盖玻片，略微压片，用滤纸条吸去盖玻片四周多余的水分。2、将装片置于载物台上，在明视野用聚焦螺旋聚焦样品，将观察到的夹竹桃花丝毛细胞移到视野中央。3、换上10×相差物镜和相应的相差聚光器，完全打开聚光器的孔径光阑，装上绿色滤光片，调节光源，使视野内亮度均匀。4、拨出目镜，插入中心望远镜，找到环状光阑的亮环和相板的黑环，调节聚光器，使二者完全重合。5、拔出望远镜，插入目镜，镜检、拍照。6、换用高倍相差物镜观察时，要换用与之相匹配的聚光器环状光阑，重复以上调节步骤。三、荧光显微镜观察人口腔上皮细胞1、用灭菌的牙签刮取口腔上皮细胞，涂于洁净的载玻片上，滴上一滴罗丹明123染液，于37℃2、盖上盖玻片，吸去多余的液体。3、将装片置于载物台上，10×物镜下找到样品焦面，关闭透射光，置于激发光为蓝光、发射绿色荧光的滤片组合块下观察线粒体。必要的话，可换用40×荧光物镜进一步观察、拍照。四、测微尺的使用操作1、卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺有刻度一面向下装在目镜镜面上，再旋上目镜的上透镜。2、将镜台测微尺有刻度一面朝上放在载物台上夹好，使测微尺刻度位于视野中央。调焦至看清镜台测微尺的刻度。3、小心移动镜台测微尺和目镜测微尺(如目镜测微尺刻度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦)，使两尺左边的"0"点一直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重复的直线(图1)。4、记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按下式计算目镜测微尺每格的长度等于多少μm目镜测微尺每格的长度（μm）=镜台测微尺的格数/目镜测微尺的格数*10图1目镜测微尺的标定上：目镜测微尺，下：镜台测微尺五、几种不同类型细胞形态的观察及大小测量观察各种装片标本，注意不同类型细胞的形态及大小差异。用目镜测微尺和镜台测微尺测量细胞的长、短径或半径的长度，每类被测物测3个数据，最后取平均值。[实验结果]将上述观察及测量结果记录于下表，并计算细胞的大小。细胞名称形态特征长、短径或半径（微米）细胞面积（平方微米）[注意事项]1、荧光镜下观察细胞时，由于荧光易淬灭，观察时要尽量快。2、荧光探针都有一定的毒性，因此操作时要注意防止污染皮肤和环境，如弄到手上或桌子上，应及时冲洗。[实验报告]完成上述表格。思考：不同物镜放大倍数下，目镜测微尺每格的单位是否相同？思考：不同类型显微镜的适用范围有何不同？实验二细胞膜的渗透性观察[实验目的]通过本实验，学习、掌握观察、研究细胞膜物质通透性作用的实验方法与技能。了解细胞膜对物质通透性的一般规律。了解溶血现象及其发生机制。[实验原理]细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。渗透作用是细胞膜的主要功能之一。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。当红细胞置于不同等渗溶液中时，由于对各种溶质的通透性不同，因此有的溶质分子可透入，有的溶质分子则不能透入，能透入的溶质分子的速度也不同。当溶质分子进入红细胞使细胞内溶质浓度增加时，导致水的摄入。当红细胞吸水膨胀到一定程度时，细胞膜破裂，血红素溢出即红细胞发生溶血。由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同。该实验完成需时3学时。[实验材料、试剂和仪器]一、仪器普通光学显微镜、手术刀、秒表、载玻片、盖玻片、吸管、小烧杯、试管等。二、材料鸡或鸭血细胞三、试剂1.5％氯化钠，生理盐水，0.17mol／L氯化钠，0.17mol／L硝酸钠，0.12mol／L硫酸钠，0.12mol／L草酸钠，0.32mol／L葡萄糖，0.32mol／L甘油，0.32mol／L乙醇，0.32mol／L丙醇。[实验步骤]一、红细胞渗透压的观测取一小烧杯，加入新鲜鸡血，迅速以十倍生理盐水稀释，制成鸡血细胞悬浮液。取5支试管，编号后依次向各试管加入1.5％氯化钠5，3，2.16，1，0mL，然后分别向各试管加入蒸馏水，使每一试管总体积达到5mL，配成一浓度梯度的氯化钠溶液。向每一试管加入0.5mL鸡血细胞悬液，立即轻轻摇匀。稍停片刻后，观察溶血情况，并记录于表一。二、红细胞对不同溶质的渗透性观察取8支试管编号，依次向各试管加入等渗溶液0.17mol／L氯化钠，0.17mol／L硝酸钠，0.12mol／L硫酸钠，0.12mol／L草酸钠，0.32mol／L葡萄糖，0.32mol／L甘油，0.32mol／L乙醇，0.32mol／L丙醇各5mL。向每一试管加入0.5mL鸡血细胞悬液，立即轻轻摇匀。观察溶血情况，并记录于表二。[实验结果]将实验结果记录于表一、二，并加以分析。试管编号实验项目123451.5％氯化钠（mL）532.1610蒸馏水（mL）022.8445氯化钠浓度（％）1.50.90.650.30血细胞悬液（mL）0.50.50.50.50.5细胞形态及溶血情况结果分析表一红细胞渗透压的观测试管编号是否溶血溶血时间结果分析1、0.17mol／L氯化钠2、0.17mol／L硝酸钠3、0.12mol／L硫酸钠4、0.12mol／L草酸钠5、0.32mol／L葡萄糖6、0.32mol／L甘油7、0.32mol／L乙醇8、0.32mol／L丙醇表二红细胞对不同溶质的渗透性观察[注意事项]新鲜鸡血提取后要立即稀释，否则会凝固结块，影响后续实验操作。[实验报告]完成表一、表二并对实验结果加以分析。实验三活体染色及不同细胞结构的观察[实验目的]通过本实验，使学生掌握活体染色的基本原理和一般方法，并通过对绿豆根根尖细胞液泡系和洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的活体染色观察、了解液泡系和线粒体的形态及其在细胞中的分布。观察胞间连丝及叶绿体的形态及其在细胞中的分布。[实验原理]活体染色是利用某些无毒或毒性较小的染色剂显示出细胞内某些天然构造存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以至引起细胞死亡的一种染色方法。其主要特征是染料的堆积，即染料的胶粒固定、堆积在细胞内某种特殊的构造里面。这种堆积主要是受染料分子的电荷影响。因为碱性染料的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，它们彼此之间会发生电吸附作用（静电吸附）。活体染色的另一特征是专一性。例如中性红只染液泡系，詹纳斯绿－B只染线粒体，而细胞质和细胞核在活体染色过程中并不被染色。只有当细胞死亡或开始死亡时，细胞质和细胞核才能被染成均匀一致的颜色。该实验完成需时4学时。[实验材料、试剂和仪器]一、仪器普通光学显微镜、双面刀片、载玻片、盖玻片、吸管等。二、试剂Ringer氏溶液、1/3000浓度的中性红溶液、1/5000浓度的詹纳斯绿－B溶液三、实验材料黄豆（或绿豆）幼根根尖，洋葱鳞片叶表皮细胞，菠菜叶，胞间连丝永久装片[实验步骤]一、液泡系的活体染色及观察1、用双面刀片把初生的黄豆（或绿豆）幼根根尖（约1－2cm长）小心切一纵断面薄片，放在预先滴有一滴1/3000浓度的中性红溶液的载玻片中央，染色15分钟。2、用滴管吸去染液，滴加一滴Ringer氏液，盖上盖玻片，镜检。二、线粒体的活体染色及观察1、用镊子撕下一小块洋葱鳞片叶表皮，放在预先滴有一滴1/5000浓度的詹纳斯绿－B溶液的载玻片中央，染色30分钟。2、用滴管吸去染液，滴加一滴Ringer氏液，盖上盖玻片，镜检。三、叶绿体的观察1、取一小块菠菜叶，放在预先滴有一滴Ringer氏溶液的载玻片中央，用镊子将菠菜叶夹碎，盖上盖玻片，镜检。四、胞间连丝的观察取一片胞间连丝永久装片，置显微镜下认真观察。[实验结果]1、中性红溶液染色结果：可见生长点细胞内有很多大小不等的被染成玫瑰红色的圆形液泡。若观察已分化长大的细胞，可见到较大的液泡，数目较少，有时只有一个浅红色的中央大液泡，其中有些深红色颗粒作布朗运动。2、詹纳斯绿－B溶液染色结果：可见线粒体被染成兰绿色，呈颗粒状或线条状，在细胞核周围分布得特别多。[实验报告]绘图示黄豆（或绿豆）幼根根尖细胞液泡系。绘图示洋葱表皮线粒体。思考：用一种活体染色剂处理细胞，为什么不能同时看到多种细胞器被染色。实验四细胞组分的分离与观察[实验目的]掌握细胞组分的分离方法（差速离心法）的原理及操作步骤，掌握离心机、组织捣碎机的使用方法。掌握细胞组分的鉴定方法。为进一步研究亚细胞组分的化学组成、理化特性及其功能奠定基础。[实验原理]差速离心是指低速与高速离心交替进行，使各种沉降系数不同的颗粒先后沉淀下来，达到分离的目的。沉降系数差别在一个或几个数量级的颗粒，可以用此法分离。样品离心时，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。将细胞充分破碎后，可用差速离心法分离细胞各组份。如用一定的介质进行组织匀浆，然后通过差速离心，先用较低的转速把比重较大的细胞核从细胞质组分及其它碎片的悬浮液中分开，再经过反复洗涤，就能得到纯净的细胞核。再用较高的转速把上清夜中的较小颗粒沉淀下来（如线粒体），从而使各种细胞结构得以分离。为了保护细胞组分的活性，全部操作过程应在0℃~4叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000r/min离心，可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。在室温下进行分离要迅速。某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。该实验完成需时6学时。[实验材料、试剂和仪器]一、仪器冷冻离心机、组织捣碎机、荧光显微镜、普通光学显微镜、解剖针、烧杯、量筒、载玻片、盖玻片等。二、材料鸭肝、菠菜三、试剂1.5%柠檬酸水溶液、0.25mol/L蔗糖-1.5%柠檬酸水溶液(pH7.4)、0.88mol/L蔗糖-1.5%柠檬酸水溶液(pH7.4)、0.35mol/LNaCl溶液、詹纳斯绿B染液、0.01%吖啶橙、生理盐水等。[实验步骤]一、细胞核与线粒体的分离与观察1、鸭子饥饿24小时后处死，剖腹取肝，剪成小块，用生理盐水洗干净。2、称取10g鸭肝，在冰浴上剪碎，加入100mL1.5%柠檬酸水溶液，用组织捣碎机充分破碎细胞（10000－20000r/min，5－10秒/次）。3、匀浆液用四层纱布过滤，取1.5mL滤液经1500g离心10min，取上清夜，移入高速离心管，保存于有冰块的烧杯中，（待分离线粒体用），沉淀即为粗核沉淀。4、在上述沉淀中加入1.5mL1.5%柠檬酸水溶液。离心（同步骤3），弃上清夜，重复步骤4两次。5、在上述沉淀中加入1.5mL0.25mol/L蔗糖-1.5%柠檬酸水溶液，制成悬浮液A，另取一离心管，加入1.0mL0.88mol/L蔗糖-1.5%柠檬酸水溶液，然后在其上滴加0.5mLA液，经3000g离心20min，弃上清夜，得到较为纯净的细胞核沉淀。6、在上述沉淀中加入0.2mL0.25mol/L蔗糖-1.5%柠檬酸水溶液，制成细胞核悬浮液。7、取一片洁净的载玻片，滴上一滴0.01%吖啶橙荧光染料，然后滴一滴细胞核悬浮液，用牙签混匀，加盖玻片，镜检。8、将步骤3中保留有上清夜的高速离心管取出，以离心力8000g离心10min，弃上清夜，留沉淀。9、在上述沉淀中加入1.5mL0.25mol/L蔗糖-1.5%柠檬酸水溶液，悬浮后离心（同步骤8），弃上清夜，留沉淀。10、在上述沉淀中加入0.2mL0.25mol/L蔗糖-1.5%柠檬酸水溶液，制成线粒体悬浮液。11、取一片洁净的载玻片，滴上一滴詹纳斯绿B染液，然后滴一滴线粒体悬浮液，用牙签混匀，染色5min，加盖玻片，镜检。二、叶绿体的分离与观察1、选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35mol/L氯化钠溶液15mL中置组织捣碎机中。2、利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆，3~5min。3、用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。4、取滤液4mL在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。5、将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。6、沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。7、取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片后即可观察。8、观察叶绿体的形态结构、叶绿体发射荧光的现象。[实验结果]普通显微镜下，细胞核呈圆球形，可清楚地看到细胞核内的核仁。线粒体呈颗粒状或线状，被染成兰绿色。荧光显微镜下，细胞核发出绿色荧光。普通显微镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，内部含有较深的绿色小颗粒－基粒。荧光显微镜下，未染色的叶绿体发出火红色荧光，吸附吖啶橙后发橘红色荧光，其中混有细胞核的发绿色荧光。[注意事项]1、为了保护细胞组分的活性，全部操作过程应在0℃~42、荧光镜下观察细胞时，由于荧光易淬灭，观察时要尽量快。3、荧光探针都有一定的毒性，因此操作时要注意防止污染皮肤和环境，如弄到手上或桌子上，应及时冲洗。[实验报告]1、绘图表示观察结果。2、思考题：要获得高活性的细胞组分，在分离过程中有哪些注意事项。3、思考题：细胞内各组分如何分离？分离原理是什么？实验五细胞化学成分的分析[实验目的]通过本实验，了解细胞化学方法的基本原理，掌握DNA、RNA、酸性蛋白和碱性蛋白在细胞内分布的检测方法。[实验原理]细胞化学方法，是在保持细胞结构基础上，利用某些化学试剂和细胞内的某些物质发生化学反应，产生在显微镜下可观察的有颜色的反应产物，从而可对该物质在细胞中的含量及所处位置进行定性与定量分析的一种细胞组分的分析方法。DNA经弱酸（1mol/LHCl）水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与希夫试剂反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA的部位呈现紫红色阳性反应。这就是显示DNA的传统细胞化学方法Feulgen反应。DNA和RNA由于聚合程度不同而对碱性染料有不同的亲和力，可进行选择性染色。由于甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它对聚合程度高的DNA有强的亲和力，而派罗宁分子只有一个相对正电荷，它仅和聚合程度较低的RNA结合，因而DNA和RNA可被甲基绿和派罗宁分别染色。由于不同蛋白质分子中所带有的碱性基团和酸性基团的数量不同，在不同的pH溶液中，整个蛋白质所带的正负电荷也就不同，如在生理条件下，整个蛋白质带负电荷多，则为酸性蛋白质，反之为碱性蛋白。据此，可将标本（经三氯醋酸处理，除去核酸，消除影响因素）用不同pH的固绿染色液染色，使细胞内的酸性和碱性蛋白分别显示出来。该实验完成需时6学时。[实验材料、试剂和仪器]一、仪器普通光学显微镜、水浴锅、载玻片、盖玻片、吸管、小烧杯、试管、手术刀、解剖剪、镊子、解剖盘等。二、材料洋葱根尖、蟾蜍三、试剂希夫试剂、亚硫酸水、1M盐酸、5％三氯醋酸、45％醋酸、70％乙醇、甲基绿－派罗宁混合液、0.1％酸性固绿染液（pH2.0－2.5）、0.1％碱性固绿染液（pH8.0－8.5）、乙醚等。[实验步骤]一、细胞内DNA和RNA的显示方法（一）Feulgen反应1、切取长约0.5cm的洋葱根尖末端，在60℃的1M2、希夫试剂染色30min，直至根尖出现紫红色为止。3、用亚硫酸水浸泡2min。4、重复步骤3三次。5、流水冲洗5min。6、将根尖放在载玻片上，加一滴45％醋酸，压片镜检。7、对照：在材料进入1M热盐酸水解前，用5％三氯醋酸在90℃（二）Brachet反应1、取一只经乙醚麻醉的蟾蜍，取血制成血涂片，晾干。2、70％乙醇固定10min，晾干。3、将甲基绿－派罗宁混合液滴于涂片上，覆盖血膜，染色20min。4、用清水洗净染液，吸去多余水分，晾干后镜检。二、细胞内酸性蛋白和碱性蛋白的显示方法1、取一只经乙醚麻醉的蟾蜍，取血制成血涂片，晾干。2、取两张晾干的血涂片与70％乙醇固定5min，清水洗净。3、将涂片浸于5％三氯醋酸，90℃4、将一张涂片浸入0.1％酸性固绿染液（pH2.0－2.5）染色3min，清水洗净染液，晾干镜检；另一张涂片浸入0.1％碱性固绿染液（pH8.0－8.5）染色30min，清水洗净染液，晾干镜检。[实验结果]经Feulgen反应的洋葱根尖细胞细胞质、核仁无色，染色质被染成紫红色。对照组洋葱根尖细胞细胞质、细胞核均无色。经Brachet反应染色的蟾蜍血涂片细胞核被染成兰绿色，核仁和细胞质被染成红色。经酸性固绿染色的蟾蜍血涂片，整个细胞质和核仁中蛋白质被染成绿色。经碱性固绿染色的蟾蜍血涂片，只有细胞核内染色质被染成绿色。[注意事项]希夫试剂见光易氧化分解，失去染色能力。因而在实验操作过程中，应注意遮光操作。[实验报告]绘图并说明实验结果。实验六动物细胞的原代培养和传代培养[实验目的]通过本实验，了解、掌握动物细胞的基本培养技术，为进一步的以培养细胞为材料的细胞生物学及分子生物学研究打下基础。[实验原理]动物细胞培养技术是用无菌操作的方法将动物体内的细胞、组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断地生长、繁殖，人们借以观察研究细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象的一种细胞生物学研究技术。动物细胞培养技术广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、细胞工程学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。由动物体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。培养的细胞经一段时间的培养后，由于密度过大、生存空间不足，易引起营养枯竭，细胞不再生长。这时将细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶培养，使细胞得以继续分裂生长，此即为传代培养。该实验完成需时12学时。[实验器材]一、仪器倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、磁力搅拌器、过滤器、干燥箱、解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板等。二、材料小鼠、Hela细胞[实验试剂]PBS缓冲液、RPMI1640培养液（含10％小牛血清和青霉素、链霉素）、细胞消化液（0.5％胰蛋白酶和0.4%EDTA混合液）、75％乙醇、Hanks液等。[实验步骤]一、动物细胞的原代培养1、用颈椎脱臼法迅速处死小鼠，将小鼠浸入75％乙醇中消毒1min后取出，放在超净工作台上的解剖盘上，剖腹取出肝脏或肾脏，置无菌培养皿中，用灭菌的PBS缓冲液冲洗三次，用手术剪将组织修剪成1mm3左右的小块，用PBS缓冲液洗至发白，用无菌滤纸吸去多余缓冲液，将组织块移入无菌离心管。2、在离心管中加入1mL混合消化液，盖上盖子，于37℃3、向离心管中加入3mLPBS缓冲液，制成细胞悬液，于300g离心力下离心5min，弃上清夜。4、向离心管中加入3mLRPMI1640培养液（含10％小牛血清和青霉素、链霉素），制成细胞悬液。5、将上述细胞悬液接种至培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。二、动物细胞的传代培养1、将Hela细胞或上述原代培养细胞从培养箱中取出，于超净工作台上，将旧的培养液倒掉，加入少许混合消化液，消化10min（消化过程中随时在显微镜下观察被消化细胞的形态，如果细胞开始变圆，即可终止消化）。2、倒掉消化液，加入5mL新鲜培养液，制成细胞悬浮液。3、取一半细胞悬浮液至另一培养瓶中，在两个培养瓶中分别3mL新鲜培养液，盖好瓶塞，至二氧化碳培养箱继续培养。[实验结果]原代培养接种后几个小时即能观察到细胞开始贴壁生长，7天左右形成单层。传代后的细胞在2小时左右开始贴壁生长，4天左右形成单层，此时需再次进行传代培养。[注意事项]1、注意无菌操作，防止细胞污染。2、如发现细胞有污染现象，应及时采取措施处理。[实验报告]1、记录实验过程和细胞生长状况。2、思考：在动物细胞培养过程中如何达到无菌操作？实验七培养细胞的计数和活性鉴定[实验目的]通过本实验，了解、掌握培养细胞的计数方法及活性的鉴定方法。[实验原理]细胞计数法是细胞培养过程中的一项基本技术，在细胞生物学的实验中，往往要进行细胞的计数，以调整细胞的密度，确保细胞顺利生长，同时细胞计数方法也是绘制细胞生长曲线的基础。细胞计数的原理较简单，只要从需要计数的细胞悬液中取一定体积的悬液，稀释后在显微镜下利用细胞计数板进行计数，即可换算出原始细胞悬液中细胞的密度以及细胞总数。培养细胞活力的鉴定也是细胞培养必不可少的一种基本技能。细胞培养中检查细胞死活可以通过死、活细胞对色素不同的吸附能力来判断细胞死活。如在台盼蓝染料作用下，死细胞被染成蓝色，活细胞不着色。该实验完成需时3学时。[实验器材]一、仪器血细胞计数板、普通光学显微镜、乳头吸管等。二、材料各种培养细胞。[实验试剂]0.5%台盼蓝生理盐水溶液、0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液、0.1％结晶紫生理盐水溶液、生理盐水、Hanks液等。[实验步骤]一、培养细胞活性鉴定1、台盼蓝染色法：用混合消化液消化培养细胞，制备细胞悬液。取0.5mL的细胞悬液，加入0.5mL0.5%台盼蓝染液，染色3min后即可镜检。活细胞不着色，死细胞被染成蓝色。2、结晶紫染色法：0.1％的结晶紫染液与细胞悬浮液按体积1：2混合，立即镜检，活细胞染成蓝色。二、培养细胞的计数1、细胞计数板的结构。细胞计数板有两个正方形计数室组成，每个计数室被分为25个体积为0.1mm3的大方格，每个大格又均分为16个小格。2、用擦镜纸将计数板擦干净，滴加上述已染色的细胞悬液于计数板上盖玻片的边缘，使细胞悬液自然流入计数室内（注意不要产生气泡）。3、在10×物镜下计算四个大格内的总细胞数和死亡细胞数，如果细胞正好停留在格线上，按照数上不数下，数左不数右的原则计数。[实验结果]按下列公式计算细胞浓度和细胞活力：细胞浓度(个/mL)=4大格中细胞总数×104×稀释倍数/4活细胞百分比＝（细胞总数－死亡细胞数）/细胞总数×100％[注意事项]1、因台盼蓝有轻度的毒性，染色时间不宜太长。染色时间若超过15min以上，活细胞也会因受损而着色，影响实验结果。2、台盼蓝不宜久存，陈旧者有毒性。[实验报告]1、计算所计数的细胞悬液的细胞浓度、1mL细胞悬液中的细胞总数及活细胞的百分比。2、思考:为什么台盼蓝染色的时间太长会影响实验结果。实验八培养细胞的冻存与复苏[实验目的]细胞的冷冻保存与复苏是细胞培养的常规工作和必须掌握的基础技术，通过本实验，了解、掌握培养细胞的冻存与复苏的基本技术方法，为以后的综合实验奠定基础。[实验原理]长期培养的细胞生物特性容易发生变化，并且到了一定代数，就不可避免地会发生衰老和凋亡。为了保持培养细胞的生物学特性和活力，保持实验结果的一致性，一般在传代培养的早期就要把一部分细胞保存备用。细胞冻存是细胞保存的主要方法，将培养细胞及时冻存，使细胞暂时脱离生长状态，在必要的时候再进行细胞复苏，可以达到维持和保存细胞系的目的。冷冻过程中细胞内外水分都会结冰，形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。在培养液中添加保护剂，如甘油和二甲亚砜，可以降低溶液的冰点，使细胞免受冰晶形成及渗透压改变导致的伤害。液氮是细胞长期储存的理想冷冻剂。在使用过程中，常将液氮贮于特制的容器中，而细胞冻存于液氮中。冷冻细胞和复苏细胞有不同的要求，一般采用“慢冻快融”的方法。缓慢冻结，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，提高细胞内的电解质浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。快速融化，可以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，使之迅速通过最易受损的－5℃~0℃，避免由于缓慢融化使水分渗入形成细胞内再结晶而对细胞造成损害。一般在细胞从0℃降温到－25℃阶段，冷冻速度为－1～－2℃该实验完成需时6学时。[实验器材]一、仪器二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜、4℃二、材料各种培养细胞。[实验试剂]DMEM培养液、小牛血清、二甲亚砜（DMSO）或甘油、0.25%胰蛋白酶溶液、Hanks培养液、台盼蓝染液等。[实验步骤]一、培养细胞的冻存1、选对数生长期培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化并收集细胞，细胞悬浮液在700g离心力条件下离心5min，弃上清液，用Hanks液清洗细胞1~2次。2、以细胞冻存液[70％DMEM培养液＋20%小牛血清＋10%DMSO（或甘油）]稀释细胞，用吸管轻轻吹打重新悬浮细胞，充分混匀，调整细胞浓度为1×106个/mL。3、将细胞悬液分装于2mL无菌细胞冻存管内，每管加入细胞悬液约1.8mL，拧紧管盖，并在冻存管壁上做好记号。4、冻存管在4℃下存放30min，在－20℃下存放2h，在－二、冻存细胞的复苏1、用长镊子从液氮罐中取出冻存管（注意安全），立即投入盛有37℃2、取出冻存管，用75％乙醇消毒冻存管后，打开管盖，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管，并立即加入10mL37℃Hanks液，混匀后，700g3、用DMEM培养液重新悬浮细胞，调整细胞浓度约1×105个/mL，分装入培养瓶，置37℃4、用台盼蓝染液检测冻存细胞的活力。[实验结果]记录细胞冻存和复苏的全部程序，按下列公式计算细胞活力：活细胞百分比＝（细胞总数－死亡细胞数）/细胞总数×100％[注意事项]1、冻存操作和添加液氮时注意戴保护眼睛和手套，以免液氮伤人。切勿直接用手接触液氮，以免冻伤。2、塑料冻存管的管间胶圈易破，使用前一定要仔细检查。冻存细胞时，塑料冻存管一定要拧紧，以免解冻时空气突然膨胀引起爆炸和解冻时发生污染。3、液氮数量要定期检查，在发现液氮挥发1/2时要及时补充。4、冻存一年后，最好复苏培养一次，再继续冻存。5、DMSO在室温下易损伤细胞，因此，在细胞加入含DMSO冻存液后，应尽快冷冻。[实验报告]1、观察细胞冷冻与复苏后形态变化，计算细胞复苏后的存活率。2、思考：冷冻过程中为什么要用慢冻快融的方法。实验九细胞凋亡的诱导与观察[实验目的]通过本实验，了解、掌握凋亡细胞的诱导与鉴定的基本原理和实验技术。[实验原理]细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下按照自身的程序结束生命的过程，即由基因决定的自动结束生命的过程。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以又称为细胞编程性死亡（PCD）。细胞凋亡对于多细胞生物个体的胚胎发育、维持器官组织细胞数目相对平衡及抵御外来因素的干扰都有着重要意义。诱导细胞凋亡的外在因子包括物理性因子和化学性因子，前者如紫外线，后者如超氧自由基、放线菌素D等。细胞在凋亡过程中有一系列特征性的形态学、生物化学、细胞学及分子生物学的改变，如凋亡过程中，细胞内Ca2＋/Mg2＋依赖性的核酸内切酶被激活，导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，产生以180－200bp为最小单位的单体或寡聚体片段，在电泳时会呈现180－200bp整数倍大小的阶梯状条带，这是识别凋亡细胞的可靠生化特征。Hochest33258荧光染料能够和DNA特异结合，对正常细胞和凋亡细胞均能染色，受到紫外光激发可发出绿色荧光。但凋亡细胞由于染色质发生凝缩，并且有凋亡小体产生，因而呈致密浓染，而正常细胞则发出均匀荧光，因而，通过二者荧光染色的不同，可将凋亡细胞和正常细胞区分开来。该实验完成需时6学时。[实验器材]一、仪器倒置荧光显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冷冻离心机、低温冰箱、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪、微量加样器、Eppendorf离心管、10mL培养瓶、载玻片、盖玻片等。二、材料人早幼粒白血病HL－60细胞[实验试剂]PBS缓冲液、RPMI1640培养液（含10％小牛血清和青霉素、链霉素）、三尖杉酯碱（HT，1mg/mL的针剂）、放线菌素D（1mg/mL）、canoy固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1）、Hochest33258染料、细胞凋亡DNA提取试剂盒等。Hochest33258染料的配制：5mgHochest33258、10mg硫柳汞溶于100mL无NaHCO3和酚红的Hanks液中，溶解40min（室温），分装后－20℃[实验步骤]一、三尖杉酯碱诱导HL－60细胞凋亡1、实验前两天接种2瓶HL－60细胞，每瓶含6mL培养基，37℃、5％CO22、实验前2小时，当细胞密度达到70％－80％时，作以下处理：a瓶加入三尖杉酯碱，使其终浓度为1μg/mL；b瓶加入等量PBS（pH7.4）作对照。3、将a、b瓶共同放入培养箱继续培养3小时。4、2000r/min离心10min，去上清液，收集细胞。5、加入1mLPBS悬浮细胞，加入3mL固定液，固定10min。6、2000r/min离心10min，去上清液，收集细胞，加入0.5mL固定液，悬浮细胞。7、取一滴细胞悬液，滴于洁净的盖玻片上，倾斜玻片使细胞均匀分散，自然干燥。8、将盖玻片置平皿内，滴加3mLHochest33258染液，遮光染色30min后，蒸馏水洗3次，自然干燥。9、在盖玻片上有细胞的一面滴一滴封片液，迅速翻转盖玻片，封片于洁净的载玻片上。10、在荧光显微镜下镜检。二、放线菌素D诱导HL－60细胞凋亡1、取处于对数增长期的2瓶HL－60细胞（每瓶含6mL培养基），作以下处理：a瓶加入放线菌素D，使其终浓度为1μg/mL，b瓶加入等量PBS（pH7.4）作对照。将a、b瓶共同放入培养箱，37℃、5％CO22、以下步骤同一、4－9。三、凋亡细胞DNA的电泳检测1、收集上述培养瓶中剩余细胞（2000r/min离心10min，去上清液）。2、提取细胞DNA（按试剂盒使用说明操作）。3、琼脂糖凝胶电泳（1％琼脂糖，75mA，1.5小时）。4、凝胶成像分析仪内观察、拍照。[实验结果]在荧光显微镜下，正常细胞呈现均匀的蓝色，凋亡细胞表现为团块状分布的致密浓染颗粒。电泳结果显示正常细胞（即对照组细胞）DNA呈一条带，为细胞总DNA图谱；凋亡细胞DNA电泳形成典型的“梯状带”。[注意事项]1、诱导细胞凋亡的时间要准确。2、荧光镜下观察细胞时，由于荧光易淬灭，观察时要尽量快。[实验报告]1、记录实验过程和实验结果，并作简要分析。2、思考:凋亡细胞的形态学特征有哪些？实验十植物原生质体分离与融合[实验目的]通过本实验，掌握植物原生质体分离纯化的方法；原生质体活力鉴定的方法；了解、掌握细胞融合的基本原理、程序和技术方法。[实验原理]植物原生质体培养和原生质体融合是植物遗传改良的重要手段之一，而且原生质体也是研究植物细胞壁再生、细胞分裂和分化等一系列细胞遗传和生理过程的良好实验材料。不同植物细胞去壁后形成的原生质体可在人工诱导的条件下融合，产生杂种细胞，经培养可再生体细胞杂种植株，从而可以打破植物远缘杂交有性不亲和障碍，是农作物改良育种的有力工具之一。人工诱导植物原生质体融合的方法很多，如病毒介导法、电场诱导法和高聚分子诱导法等。PEG和高钙高pH相结合诱导融合的化学方法是目前应用较为广泛且效果较好的一种人工诱导植物原生质体融合的方法。该法应用PEG分子引起原生质体的聚集和粘连，然后在高钙高pH液处理下，产生高频率的融合。该实验完成需时12学时。[实验器材]一、仪器倒置荧光显微镜、超净工作台、倒置显微镜、显微数码拍摄系统、冷冻离心机、摇床、高压灭菌锅、除菌过滤器、微孔滤膜、不锈钢筛网、血球计数板、微量加样器、Eppendorf离心管、注射器、载玻片、盖玻片等。二、材料西瓜、甜瓜或黄瓜愈伤组织。[实验试剂]75％乙醇、原生质体洗液、0.5－0.7M甘露醇溶液、酶液（2％纤维素酶＋1％离析酶）、20％蔗糖溶液、0.1％荧光增白剂溶液（用甘露醇溶液配制，过滤）、FDA溶液、D2原生质体培养基、PEG溶液、高钙高pH液等1、原生质体洗液的配制：CaCl2.2H2O（终浓度10mmol/L）、KH2PO4（终浓度0.7mmol/L）、甘露醇（终浓度0.55mmol/L），用KOH调pH＝5.7，高压灭菌，置4℃2、酶液配制：纤维素酶（终浓度1％）、果胶酶（终浓度1％）。将酶粉溶于原生质体洗液中，4000r/min离心10min，用注射器抽取上清夜，0.45微孔滤膜过滤除菌后，分装小瓶，置－20℃3、双醋酸酯荧光素（FDA）溶液的配制：将FDA配制呈0.1mg/mL的丙酮溶液，于冰箱保存备用。4、PEG融合液的配制：PEG（相对分子量1500～6000、浓度40%）、葡萄糖（浓度0.3×10－3mol/mL）、二水氯化钙（浓度3.5×10－6mol/mL）、磷酸二氢钾（浓度0.7×10－6mol/mL）5、D2原生质体培养基的配制：成分含量（mg/L）成分含量（mg/L）无机成分（mg/L）NH4NO3270H3BO32.0KNO31480MnSO44H2O5.0CaCl22H2O900ZnSO44H2O1.5MgSO47H2O900KI0.25KH2PO480Na2MoO42H2O0.10FeSO47H2O27.8CuSO45H2O0.015Na-EDTA37.3CoCl26H2O0.010有机成分（mg/L）m-肌醇100生物素0.04烟酸4.06－BA0.6硫胺素－HCl4.0水解乳蛋白10％甘氨酸1.42，4-D1吡哆醇－HCl0.7葡萄糖0.4mol/L叶酸0.4蔗糖2000PH=5.8[实验步骤]一、原生质体的分离与纯化1、按2g原生质体：10mL酶液的比例，将生长旺盛的原生质体和酶液放入无菌三角瓶中，置于摇床上，60r/min，25℃2、用200目的不锈钢网过滤酶解后的原生质体，除去未消化的组织残渣。3、滤液加入等体积的原生质体洗液，取1.5mL以800r/min速度离心5min，弃上清液。加入1.5mL原生质体洗液悬浮原生质体，重复离心一次，弃上清液。4、加入1.5mL20％蔗糖溶液，悬浮原生质体，以500r/min速度离心5min。5、小心吸取上层原生质体，移入另一离心管，用原生质体洗液和D2培养基各洗一次。6、弃上清液，将原生质体悬浮于D2培养基，调密度为1×106/mL，培养。二、原生质体纯度与活力的鉴定1、将FDA染液稀释10倍，取0.5mL原生质体悬液，加入稀释的FDA溶液0.01mL，室温下染色5min。2、取一滴染色后的原生质体，制成临时装片，置荧光显微镜下镜检。3、取0.5mL原生质体悬液，加入等体积0.1％荧光增白剂溶液，室温下染色5min。4、用0.55M甘露醇溶液洗涤3次，加入0.5mL培养液重新悬浮。5、取一滴染色后的原生质体，制成临时装片，置荧光显微镜下镜检。三、原生质体融合1、将1～2滴不同原生质体混合物（密度分别为105～106/mL）滴入小培养皿，静置8～10min。相对方向加入2滴40%的PEG溶液，静置10min，每间隔5min，依次加入0.5mL、1mL和2mL原生质体洗液洗涤。最后用培养基洗1～2次即可进行培养。2、将上述培养皿置倒置显微镜下观察原生质体融合过程。[实验结果]1、原生质体经FDA染色后，在荧光显微镜下观察，有活力的原生质体发出绿色荧光（这是由于FDA进入原生质体，经脂酶的作用而发出绿色荧光），无活力的原生质体没有荧光。2、经荧光增白剂染色后，在荧光显微镜下观察，细胞壁完全脱净的原生质体周围不会发出绿色荧光，而细胞壁没有脱净的原生质体周围会呈现绿色荧光。3、两种原生质体加入PEG融合液后，只发生粘连，在洗涤过程中才发生膜融合。核融合通常发生于融合体第一次有丝分裂过程中。[注意事项]1、整个实验过程注意无菌操作。2、原生质体融合时，在第二、三次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体会破碎死亡。[实验报告]1、根据实验结果，按下列公式计算原生质体活力与纯度。原生质体活力（％）＝有活力的原生质体数/原生质体总数×100原生质体纯度（％）＝完全脱壁的原生质体数/原生质体总数×1002、拍摄或图绘原生质体融合过程。3、思考：酶解液、原生质体洗液及原生质体培养液中，为何要保持较高的渗透压？如何测定原生质体的活力与纯度？实验十一脂质体介导的GFP在培养细胞中的表达[实验目的]通过本实验学习脂质体介导法转染技术；以GFP为例，了解、学习报告蛋白在细胞生物学中的应用。[实验原理]绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）是从水母体内分离得到的蛋白质，该蛋白能够自身催化形成发色结构并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光。GFP是一种独特的报告蛋白，是目前唯一能在活细胞中表达的发光蛋白，可在多种原核细胞和真核生物中表达，没有细胞或位置表达的专一性，无需外源反应底物，无需进行细胞或组织的固定和渗透处理。GFP既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害，表达检测方便，可广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。GFP的紫外吸收峰值和发射峰值分别为395nm和509nm，可以产生清晰明亮的绿色荧光，通常均匀分布在整个细胞中。现在已经获得几种突变GFP，发光效率更高。在增强型重组GFP质粒（pEGFP-C1/2/3）中，GFP序列位于CMV启动子下游，可在真核细胞中瞬时表达。将外源DNA导入细胞的方法有很多种，如显微注射、磷酸钙-DNA共沉淀法、脂质体介导法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法等。脂质体是一种人工合成的膜泡，具有与生物膜相似的磷脂双分子层结构，可以与受体细胞膜融合，从而将外源DNA转入宿主细胞。这种方法转染效率高、使用简便，现已被许多实验室采用。该实验完成需时8学时。[实验器材]一、仪器超净工作台、细胞培养箱、倒置荧光显微镜、移液管、离心管、微量加样器、培养皿等。二、材料