水稻细菌性条斑病菌的pcr检测

水稻细菌性条斑病菌的pcr检测

水稻细菌带的特征是由水稻科或硫加收引起的。在亚洲和国内，由水稻生产引起的细菌水稻条件生殖，给水稻生产带来严重影响。它的危害仅次于水稻的白叶枯萎。该病原菌可随种子调运而传播,很多国家和地区已将其列为检疫性细菌,并限制从疫区进口水稻种子。目前已经建立多种检测手段对水稻细菌性条斑病菌实施检测。经典的产地检验、育苗生长观察法、选择性分离、噬菌体检测、致病性测定、免疫分离和血清学检测技术仍是各国现阶段普遍采用和认可的检测技术;PCR技术以其快速简便、灵敏度高、特异性强的优点,成为研究的热点,在各个领域包括植物检疫方面得到广泛应用和迅速发展。已经有PCR技术应用于水稻细菌性条斑病菌的检测,但除了TaqMan探针实时荧光PCR技术之外,目前研制的其它PCR技术不能将其和水稻白叶枯病菌很好地区分开。本文设计并合成检测水稻细菌性条斑病菌的专化性引物,对水稻细菌性条斑病菌及带菌种子实施了专化性的检测。1材料和方法1.1试验中的菌株和种子样品供试细菌性条斑病菌、水稻白叶枯病菌菌株和其它参试菌株见表1。带菌的水稻种子采自江苏省泗洪县自然病田和江苏省农业科学院人工接种试验田。1.2菌体的制备将供试菌株移于营养琼脂(NA)斜面上,NA平板上划线培养48h后,挑取单菌落在LB培养液中振荡培养(28℃、180r·min-1)24h。取培养菌液1.5mL,6000g离心5min,收集菌体。菌体用1mL0.01mol·L-1的PBS缓冲液(pH7.4)悬浮,再离心洗涤3次后,用1.5mLPBS缓冲液悬浮。所得菌液96℃处理5min后,冷冻保存备用。振荡培养的菌液同时用系列稀释法测定菌液浓度。1.3电子转移蛋白及跨膜蛋白基因的合成根据GenBank上登录的水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的电子转移黄蛋白α亚基和跨膜蛋白基因(AY319937、AY319941),经序列比较,设计了1对引物,由TaKaRa(大连)公司合成。1.4血清白蛋白、tween-20l-1l-1l-1l-1l-1l-1l-1313.4.4、8.2.4.4重组菌4.2.4和5u1.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4重组菌液8.2.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.反应体积50μL:10×buffer5μL、25mmol·L-1MgCl23μL、25mmol·L-1dNTP1μL、20mg·mL-1牛血清白蛋白(BSA)2.2μL、1%Tween-200.6μL、20μmol·L-1引物各1μL、5U·μL-1Taq酶0.2μL、菌液4μL,灭菌双蒸水补足至50μL,混匀离心后加灭菌石蜡油1滴(约20μL)。1.5循环循环的选择PCR反应程序为94℃5min;94℃30s,62℃1min,72℃1min,35个循环;72℃10min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳(80V、1h)后,溴化乙锭染色(20～30min),凝胶成像系统紫外光下观察结果。1.6pcr检测检测取健康稻种和病种各50g,分别脱壳后,100mL无菌水4℃浸泡2h,浸泡液10000r·min-1离心10min,弃上清,重复2次,沉淀用无菌水定容至2mL,用建立的PCR技术进行检测。2结果与分析2.1差异设计1对专化性引物的筛选将AY319937和AY319941利用GenBank通过序列分析比较,根据其位点差异设计1对专化性引物。XoocF:5′-ATATTGGGCTGGTGGGTGA-TC-3′和XoocR:5′-TTGGTACGCGATGCCCTTTGCGACGG-3′。利用这对引物,理论上可以从水稻细菌性条斑病菌中扩增出1条338bp的片段。2.2稻条斑病菌的pcr检测利用设计的引物和建立的PCR体系对供试的水稻条斑病菌、水稻白叶枯病菌和其它供试菌株进行测试。结果显示:只能从供试的条斑病菌中扩增出1条约350bp的条带,白叶枯病菌和其它所有供试菌株均无扩增信号,说明设计的引物和建立的PCR能够专化性检测水稻条斑病菌,结果见图1。由于参试菌株较多,除条斑病菌和白叶枯病菌外,图1中只显示了部分其它菌株的检测情况,详见图注。2.3灵敏度测定结果将已知浓度的菌悬液按10倍倍比稀释,制备5×107～5×10-1cfu·mL-1菌悬液,进行灵敏度测定,当菌悬液浓度为5×103cfu·mL-1时,仍可以检测到信号,即该方法可以检测到20个菌体,结果见图2。2.4稻种抗菌剂多态性对1份健康稻种浸出液、3份自然发病和3份人工接种发病植株的稻种浸出液进行检测,结果显示,建立的PCR体系分别从2份自然发病和2份人工接种发病植株的稻种(当年采集)浸出液中扩增出条斑病菌的1条特异性条带;对健康稻种浸出液没有扩增信号,另外2份病种(前一年采集)也未扩增出信号,结果见图3。3白叶枯病菌和条斑病菌的pcr检测与鉴定目前已有许多种检测技术应用于水稻白叶枯和细菌性条斑病害的检验检疫。传统的产地检验、育苗生长观察法和相关检测技术由于灵敏度低和耗时长,已经不能适应新形势下的植物检疫;而对于选择性分离,至今仍没有分离水稻种子上条斑病菌理想的选择性培养基;利用噬菌体技术检测虽然具有简单快速的优点,但是由于噬菌体的专化性,容易造成假阴性以致漏检;致病性测定法也具有季节条件的限制;血清学方法虽然灵敏、快速,但受限于抗血清的质量和专化性,容易造成假阳性。随着分子检测技术的兴起,PCR技术以其特异、灵敏、快速和简便等突出优点在植物检疫方面得到了广泛应用与迅猛发展。目前已发展了多种不同的PCR检测技术应用于水稻白叶枯病菌和条斑病菌的检测与鉴定。如TaqMan探针实时荧光PCR方法,通过所设计的2个特异性探针对水稻白叶枯病菌与水稻细菌性条斑病菌进行实时荧光PCR检测,能分别特异性检测到这2种病原菌。此方法虽然快速、准确、灵敏,但是技术条件高,设备昂贵,普及推广受到很大限制。已有文献报道,通过专化性引物来检测白叶枯病菌和条斑病菌,但是由于这2种病菌是水稻黄单胞菌的不同致病变种,在分子遗传学上非常近似,研制的PCR检测技术存在交叉反应,很难把白叶枯病菌和条斑病菌完全区分开来。水稻细菌性条斑病和白叶枯病可以在同一植株甚至同一叶片上发生,因此,稻种上可能会同时带有这2种病菌,需要准确灵敏的检测技术对这2种病菌进行检测和区分。本研究也试图通过16S、23SrDNA和ITS序列比对来设计引物,但都没有找到足够的差异位点,最终从GenBank上发现了水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的电子转移黄蛋