肌动蛋白微丝在伪足形成中的作用

肌动蛋白微丝在伪足形成中的作用

伪脚是最原始的活动器官，包括maba细胞和其他亲乳细胞。目前认为,伪足的形成是由于骨架再组装驱动,特别是肌动蛋白微丝骨架的重组。伪足表现为一个突出的小泡,有时沿着下层基质变得扁平(像扁平足),有时更圆或离开表面(像头足)。荧光显微镜和电子显微镜下发现,这个区域总是包含有密集的纤维状肌动蛋白(F-actin)微丝网络和少量的微管。在活体细胞中,肌动蛋白(actin)的聚合主要发生在细胞延伸的边缘,通过膜和微丝末端之间新增肌动蛋白单体的方式。用细胞骨架干扰剂限制actin的聚合,提供了直接的证据来说明actin微丝在移动中所起的作用。尽管actin微丝在伪足形成时所起的作用已被人们接受,但对于产生推力的机理仍有不同见解。涉及到推力的模型,从肌动蛋白聚合在膜上直接起作用到肌浆球蛋白的收缩或可利用的凝胶渗透压驱使F-actin网络的凝胶化等,均被提出说明伪足的扩展。肌动蛋白的形成微丝骨架(mirofilamentcytoskeleton)是细胞骨架的一种,微丝直径仅5~8nm,呈圆筒状,在细胞质中成束状平行排列或疏散成网状。它主要是由肌动蛋白组装的多聚体,和肌动蛋白结合蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和α-辅肌动蛋白等组成。前者又称为肌动蛋白纤丝(actinfilaments),它具有高度的动态性,即未组装的球状肌动蛋白(G-actin)与F-actin在胞内可以随时组装和解聚。有时可以是球状蛋白组装的单丝存在于细胞内,或几个单丝组成的束,有时也可以看到更粗的集合体,称为肌动蛋白索(actincables)。正常细胞中,G-actin与F-actin不断转换,达到平衡,并且只有聚合态的肌动蛋白才具有生物学作用。肌动蛋白是由两个形似蚕豆瓣的区域构成的球状分子,中间由一个分子多肽链相连。存在一个中缝,中缝部分是肌动蛋白的必要因子ATP或ADP的金属离子的结合部分。这些因子决定着它的稳定状态。在哺乳动物中至少发现了6种肌动蛋白肽,根据其电泳特点又将肌动蛋白分为α、β、γ3种。α-actin主要位于骨骼肌和心肌细胞,β-actin、γ-actin主要存在于非肌肉细胞中。肌动蛋白结合蛋白可以特异地与各种形式的肌动蛋白结合或分离,调节微丝的聚合、解离。细胞松弛素B则破坏微丝。微丝骨架大约有70多种肌动蛋白结合蛋白及辅助的解聚蛋白,在肌动蛋白的折叠、聚合、交联、成晶现象及运动中起主要调节作用,包括跨连接蛋白(fimbrin、ABP-120、α-actinin等)、单体结合蛋白(cofilin、profilin、CAP)、膜锚蛋白(talin、comitin、ponticulin)、F-actin片断和帽子蛋白(severin、DAip1),聚合启动子(WASP,Scar)和马达蛋白(myosin),这些蛋白常被Ca2+或磷酸肌醇等信号分子调节。如肌动蛋白的一个重要调节蛋白是profilin,它与自由单体肌动蛋白和F-actin的末端结合,阻止actin进一步聚合。profilin含有磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PIP2)结合位点,对PIP2具有高亲合性,可抑制磷脂酶C(PLC)活性和PIP2水解。profilin结合PIP2后与微丝脱离,有利于肌动蛋白聚合,调节肌动蛋白单体浓度。另外它还可作为ADPactin和ATPactin的转换因子。这些说明profilin在调节肌动蛋白聚合过程中受到磷酸肌醇信号分子的作用。微丝骨架系统是一类复杂的蛋白质纤维结构,其结构与细胞的病理过程,如细胞的趋化、粘附、粘弹等过程密切相关。与此同时,细胞形态的维持、细胞分裂、胞内物资的运输和细胞分化等活动都与细胞骨架相关。所以,胞质骨架的改变必然影响细胞功能。细胞移动的影响趋化原是单细胞生物最基本、最原始的运动形式,如变形虫、溶组织阿米巴等靠体表任何部位形成临时性的细胞质突起(伪足)作为运动器而运动。所谓的趋化性,即是细胞朝向可溶性化学刺激方向迁移。某些真核细胞,如白细胞、神经胶质细胞、内皮细胞、骨髓细胞、肝癌细胞、平滑肌细胞等体内也具有明显的趋化运动,且有些细胞自身可以分泌趋化因子。这些趋化因子在生理和非生理状况下起重要作用,如可以促进细胞迁移,刺激血管的生成,参与肿瘤细胞的移动、侵袭和转移,诱导细胞因子的转录,促使多种淋巴因子的释放等。细胞伪足形成及趋化运动是由趋化剂与细胞膜趋化受体结合后介导的主动耗能过程。它不同于细胞与外力作用下的被动变形。细胞的各种运动,如变形虫运动(或阿米巴运动)、变皱膜运动,以及细胞的吞噬活动等,都与肌动蛋白的溶胶、凝胶状态及其相互转化有关。研究发现,伪足形成过程中微丝(肌动蛋白)组装在细胞移动中起着重要作用。除了肌动蛋白的聚合,还有另外的几种可能的机理,如凝胶渗透压力,在细胞移动中也起一定的作用;如嗜中性粒细胞的趋化性伪足形成的受体作用机制,以及一系列的信号转导机制,如胞内钙离子的释放、G蛋白偶联的肌动蛋白的解聚,以及信号分子、细胞骨架不对称和有持续的分配引起的细胞的极性等,倍受研究者关注。原生动物变形虫在固体表面移动时,向前伸出一个或多个伪足,将体内部分原生质移入伪足内,后面的原生质也随着收缩前进,不断地补充向前流动的原生质,整个细胞逐渐移向前方。变形虫就是这样依靠细胞内原生质流动才向前运动和捕捉食物的。这种原生质流动,实质上是依靠微丝的肌动蛋白和肌球蛋白聚合体之间的滑动来实现的。如果变形虫经细胞松弛素B处理,即可中止原生质流动和伪足的扩散。表明微丝参与了非肌肉细胞的变形运动。高等动物中白细胞和巨噬细胞运动也与上述变形虫运动相似。在哺乳类成纤维细胞体外培养过程中,可观察到细胞膜表面皱缩,形成若干波动式的褶皱和较长的突起。细胞移动就是依靠这些褶皱和突起,不断交替与表面相接触来实现的。在移动时,原生质也跟着流动,但仅出现于细胞边缘区。如果用细胞松弛素B处理,即观察到皱缩运动受到抑制;当除去细胞松弛素B(1~2h),这种运动可逐渐恢复。由此可见,细胞产生皱膜的运动也与细胞骨架微丝有关。Francis等通过电镜,观察了鼠Sca-1+/Lin-细胞和人类KG1a细胞在细胞移动中的多样性形态。像典型的手镜形伪足、宽广的扁平足、尾足、动态的丝状伪足、伸缩纤维等。Dictyostelium细胞在其生长环境中也显示了趋化性现象,如在生长环阶段摄取细菌,及性循环阶段形成巨囊等。细胞的极性在某种形式上也是趋化的过程,如单细胞核和多细胞核的dictyostelium产生分级阶段,早期趋化时需要单个细胞迅速重组装其细胞骨架来产生cAMP,这就涉及到F-actin聚合并在相反的方向上抑制伪足。大量的研究主要在集合体阶段,细胞朝向脉动的cAMP信号方向移动,发展中的dictyostelium细胞在cAMP资源丰富区延伸伪足,改变其极性。胞膜自身力学特性的改变应用细胞及分子生物学方法,人们对阿米巴原虫、中性白细胞以及部分癌细胞,如恶性黑色素瘤细胞的趋化行为已有相当的研究,但对于趋化运动的机理、伪足形成的机制还远未达到详细的了解,如趋化相关受体机制、伪足形成的胞内信号机制、伪足形成的亚细胞结构基础(如细胞骨架等)等机制。对上述问题的研究将极大提高对伪足形成过程及相关趋化机理的认识,并促进癌转移、免疫炎症等医学问题的研究。癌细胞伪足形成及趋化运动是癌细胞侵袭过程中的重要生物学行为。伪足形成涉及一系列的复杂的相互作用,如趋化剂和趋化受体的结合及有关信号机制、细胞膜局部力学特性的改变、肌动蛋白解聚及渗透压的作用、肌动蛋白聚合以及钙离子的作用。这些研究对于在细胞生物学水平认识伪足形成极性或细胞趋化运动方向性的相关机理具有重要的理论和应用意义。为解释促使伪足形成的趋动力,形成了很多研究模型,它们主要建立在肌动蛋白生物化学和某些细胞在趋化液刺激下其内部细胞骨架改变的基础上。以此两种材料研究居多:多形核白细胞(PMN)和Dictyostelium。并根据其细胞的变形提出了两种很有影响力的模型,分别是PMN模型和皮层扩展模型。皮层扩展模型认为,经过趋化受体刺激后,局部肌动蛋白的聚合和跨连接是使细胞伪足形成的瞬间原动力。而后跟随的肌动蛋白凝胶的渗透膨胀引起微丝的解聚,促进伪足的进一步扩展。而PMN模型则认为,起初伪足延伸的作用力是局部的Ca2+激活的肌动蛋白凝胶的解聚,由此产生的渗透力膨胀使得细胞膜向外突出,于是形成了伪足。而PMN模型对伪足形成阶段肌动蛋白解聚和聚合方面作了明确的区分。它认为,受体产生的信号转导以及通过Ca2+激活的凝胶蛋白的调节是引起局部肌动蛋白解聚的原因。接着肌动蛋白凝胶在细胞边缘的瞬间分裂和膨胀,导致了膜的突出。由此看出,渗透压是驱动伪足形成的原动力。后来的肌动蛋白的重聚和跨连接加速和稳定了新的伪足的形成。肌动蛋白的重聚开始于PI代谢循环。有学者应用微管吸吮技术揭示在瘤细胞中的伪足形成有两个时相:膜泡阶段和规则延伸。此过程通过分开的胞内信号的调节而完成。IV型胶原激活了G-蛋白偶联的受体,刺激趋化,引起了短暂的胞内钙离子的释放。运用pertussistoxin(PT)限制细胞内微丝骨架的组装,即阻断了G-蛋白偶联的actin的聚合,则细胞仍有小泡向外延伸,说明渗透压在起作用。然而,也有人研究发现胞内钙离子的增加对于肌动蛋白聚合并不是必须的。伪足的形成机理细胞骨架在细胞的粘附、伪足形成等特性和过程中,起着非常重要的作用。现代研究越来越表明,粘附分子-受体-细胞骨架之间的相互作用,在胞内外的信号传递过程中,起着越来越重要的作用。因此,对于特定细胞、特定胞外信号,肌动蛋白聚合和肌动蛋白微丝的动态分布在局部细胞移动中所起的作用更不容忽视。许多细胞的移动与肌动蛋白和肌浆球蛋白I、II有关。除肌动蛋白聚合之外,细胞的移动还有其他几种可能机理,如静电压力、胶体渗透压、局部的跨膜渗透压、界面张力或界面压力等。实验表明,胶体和跨膜渗透压最可能支配细胞的动态移动。为了分析肌动蛋白聚合和肌动蛋白凝胶的支配伪足形成的相关规律,人们在研究Acrasisrosea和Protostelium噬真菌体等阿米巴的肌浆球蛋白细胞骨架结构和功能时也发现,它们的F-actin束从内生的质膜与外部的质膜间形成伪足,而那里也定位着G-actin。于是得出结论,这些肌动蛋白束形成了一个网络支架驱动着伪足的形成,因此得以继续组装更多松散的F-actin网络。一些两极伸长的Acrasisrosea阿米巴也含有长束的F-actin,横越整个细胞并且遥控着散在细胞中的应力纤维棒,或形成星状或多边形混合物围绕在收缩性的液泡周围。它们也许在收缩性上起着重要作用。结合从前发现,伪足能够通过actin和肌浆球蛋白的相互作用或者只是通过actin的聚合而形成,由此得出结论,actin微丝束趋动着细胞伪足的延伸。在伪足形成时,单个的actin微丝并不能充分刚性地推动细胞膜外突,尽管它有巨大的力量。也有人提出伪足形成的两个次序性事件是,首先F-actin束的形成和它们的延伸超过了细胞总体的边缘,明显的表现是伪足形成时细胞膜的突出。其次,具有凝胶性质的F-actin网络骨架的形成扩充了伪足或者填充了它们的空间,而这正如皮层扩展模型中所预料到的一样。当阿米巴突然改变了移动的路径,如伪足被收回,收回的纤维在伪足刚刚出现的区域形成。这表明,相对稳定且动态的F-actin束是伪足首要的支撑元素,首先出现在伪足的延伸和扩展中,并在其收回时被破坏。Hodgson等曾以黑色素瘤细胞作为材料,研究其伪足形成机理,瘤细胞展示了同多形核白细胞和低等的真核细胞Dictyostelium一样的阿米巴运动,它们的移动特征是伪足伸出到细胞的外围。当前绝大部分的阿米巴趋化机理来自于研究PMN白细胞和Dictyostelium阿米巴,而此两种机理在某些方面也有相似性。伪足形成在趋化刺激作用下是最早的形态反应,而伪足是细胞皮层的特化区,它主要包含有肌动蛋白微丝的跨连接网络。局部的趋化刺激引起了细胞外围的肌动蛋白微丝的重建,而导致了细胞伪足的延伸和细胞的移动。然而伪足延伸中的胞外信号的转导机制尚未阐明。为了研究活体细胞中actin细胞骨架的动态分布,Cheng等通过在真核细胞中表达β-actin-GFP,转染入NIH3T3纤维原细胞、293T人类胚胎肾癌细胞中,通过免疫荧光染色决定其内生的actin的位置。而在趋化剂作用下可以在线观察β-actin-GFP组装过程。当趋化作用下伪足伸出时,β-actin-GFP的数量在整个临近细胞表面的皮层区开始增加,随着延伸的进展,荧光在这些细胞中变得更易于区分,并在大约1h内监测到β-actin组装的改变和相对高浓度的绿色荧光在细胞的外围扩展。Lee等又发现,Dictyostelium阿米巴伪足形成时,actin微丝组装发生了改变。荧光鬼笔环肽用于研究Dictyostelium阿米巴运动,目的是为了观察伪足延伸时局部的F-actin微丝的改变。鬼笔环肽(profilin)起初定位在细胞的外围,而新伪足的形成并未有荧光产生,表明鬼笔环肽是紧密结合在存在的F-actin微丝上,并未迅速重新定位到新形成的微丝上。随着伪足的延伸,荧光信号从潜在的扩展区消失,留下了一个actin皮层缝隙。在野生型细胞和肌浆球蛋白II重链缺失的细胞中得到了相似的结果。荧光信号从新的伪足形成区的消失,表明新的伪足形成并非建立在已存在的微丝皮层上,而是建立在局部被溶胶化作为新的actin网络皮层上。在新伪足的延伸区,荧光的缺失并不意味着这些结构缺乏肌动蛋白微丝。既然profilin非常紧密地结合到F-actin微丝上,因此交换不能迅速发生在新的伪足形成区。所以,在伪足延伸时电穿孔profilin只是出现在已存在的皮层actin网架结构中,并没有分布在新形成的actin微丝中。膜伸展以后则观察到profilin区表面的解聚表现明显。随着延伸的加速,在皮层区荧光变得模糊并散开,特别在伪足形成的中心区。有时在皮层区出现明显的荧光间隙。在缺乏myosinII的野生性细胞也有此结果,表明myosinII并不通过此机理来产生皮层间隙。细胞的极性是所有细胞的基本特征,它包含有很多细胞生物学过程,如细胞的趋化过程。如果没有极化细胞骨架,细胞不能够移动。已发现作用于细胞极性的几种蛋白成分和信号途径。生长的细胞通过伸长伪足迅速改变其极性。由于胞外的cAMP成分使细胞变得无极性,并停止运动,此时被称作萎缩反应。通过F-actin聚合