第六章 生物技术与农业

第六章生物技术与农业第一节生物技术与种植业第二节现代生物技术与养殖业学习目的和要求1.掌握植物细胞工程、基因工程和分子标记技术在植物育种中的应用。2.掌握动物转基因技术及动物胚胎工程技术的原理及应用。3.了解生物技术在动物生物反应器中的应用、以及胚胎干细胞技术在养殖业中的应用。第一节生物技术与种植业一、植物细胞工程的应用二、植物基因工程的应用三、分子标记及其在植物遗传育种上的应用植物细胞工程的应用植物细胞工程与植物育种植物细胞工程与植物快速无性繁殖和脱毒植物细胞工程与种质保存植物细胞工程与植物次生代谢产物的生产一、植物细胞工程与植物育种利用植物细胞培养技术进行突变育种

将植物单细胞培养在附加一定化学物质的培养基上，采用生物化学的方法对植物细胞进行诱变，从细胞水平上大量筛选拟定目标的突变体,然后通过愈伤组织培养和植株再生,获得突变材料,进一步培育成品种或作为育种的原始材料。(一)突变体筛选的目标

改良农作物品质抗病突变体筛选抗盐突变体筛选抗逆突变体筛选高光效突变体筛选营养缺陷型突变体筛选(二)突变体筛选的方法

1.直接选择法：主要用于抗性突变体的筛选。其原理是将大量的培养细胞置于抗生素、代谢类似物、某些金属或非金属离子等有毒或有害（低温）的培养基上，使野生型的细胞不能生长，而各种抗选择条件的突变型细胞能生长，从而达到直接选择突变体的目的。2.富集选择法：是在最低培养基上培养诱变处理的细胞，被选择的突变体细胞不能生长，但能存活，而正常细胞能活跃生长。然后用一种能使生长中的细胞中毒死亡的汰选剂淘汰掉这些细胞，最后未中毒的突变细胞恢复生长并分离出来。主要用于营养缺陷型突变体的筛选。二、植物细胞工程与植物快速无性繁殖（一）离体快速无性繁殖的概念

利用离体培养技术，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养。在短期内获得大量遗传性一致的个体的方法(技术)称离体无性繁殖。由于这种繁殖方式繁殖数量大、速度快，因此也称离体快速无性繁殖。用这种方法得到的植株群体来自一个单株(或一个单芽)，它们的遗传组成相同，这些株群可称单株无性系或单芽无性系。（二）离体快速无性繁殖的优越性加快繁殖速度培养无毒植株

杂合植株的繁殖

加速繁殖特殊材料

快速无性繁殖的另一优越性是将植物的无性繁殖从田间移至室内，使生产不受大自然的干扰，使育苗工厂化。（三）离体快速无性繁殖目的扩大繁殖珍稀植物资源和育种原始材料。扩大繁殖经济效益高，但难于繁殖的植物。繁殖和保存经过病毒鉴定的无毒原种材料。繁殖销售量大，但一时用常规(分株、扦插、播种)方法，难以满足数量上需要的植物。（四）离体无性繁殖的程序无菌母株的制备不定芽的增殖完整小植株的形成小植株的驯化和移栽再生植株的鉴定1.无菌母株的概念及其制备方法概念：在无菌条件下，用于试管内继代增殖的植物材料，称为无菌母株或“小母株”或“繁殖母株”。无菌母株制备的技术关键

培养材料的灭菌

培养基的筛选培养基筛选的原则如下：

A：因植物种类和品种而异。

B：因培养外植体类型不同而异。

C：因成苗途径不同而异。2.不定芽的增殖

将获得的无菌母株，在无菌条件下进行再次切割，继代培养加速繁殖，使之在每个芽眼处形成丛芽。这种不定芽增殖过程中，可以反复多次切割培养，使之在短期内加大芽的繁殖数量，以达到快速繁殖的目的。3.完整小植株的形成将继代增殖的幼嫩小植株，转移至生根培养基中，诱导根的分化和根系的形成，最终成为具有根、芽(生长点)的完整小植株。(1)诱导小植株根分化的技术关键①调节激素种类和浓度

A.大多数植物根分化需适当提高生长素水平，降低细胞分裂素水平。B．有些植物除去细胞分裂素，转入仅有生长素的培养基中即可根分化。C.有些植物在无激素条件下即可生根。②调节基本培养基营养组成。主要调节大量元素中硝酸盐和铵盐的含量和比例。③调节渗透压：(2)诱导根分化的方法①培养基内诱导根分化②基质生根法：将无根小植株插入预先准备好的基质中生根。③嫁接生根法：将无根小植株直接嫁接在砧木上，利用砧木的根系吸取营养和水分。4.小植株的驯化和移栽驯化中要掌握逐步过渡的原则，才能收到良好的效果。移栽前首先要进行日光锻炼，通过“晒苗”措施恢复叶绿体光合作用功能。使小苗由异养逐步过渡到自养。第二步进行湿度锻炼，使小苗逐步适应周围环境的湿度。移栽时应将小苗基部培养基冲洗干净，以避免有害微生物的侵染。移栽基质可根据植物种类不同选择基质。砂培法必须浇培养液。小苗移植后一定要注意保湿，特别保持较高的空气湿度，移植10d内空气相对湿度应保持在80％～90％，注意土壤或基质湿度不可过高。5.再生植株的鉴定(1)鉴定的意义(2)鉴定方法

细胞学鉴定：对再生株群体抽样检查根尖染色体数目以及减数分裂期的染色体行为。

形态鉴定：在田间对再生株的植物学性状进行鉴定，发现变异株再作细胞学鉴定。(五)用组织细胞培养技术工厂化

生产试管苗1.利用组织细胞培养技术生产试管苗的优点:

培养组织和细胞生长周期短，可以在短时间内生产大量试管苗；

实验材料易于获得，它不受季节、地区的限制，可随需要而大量获得材料。2.用植物组织细胞培养技术建

立植物的无性系无性系（clone）的生产与试管品种的商品化是目前植物组织培养技术的主要应用之一。无性系的建立是在植物的快速繁殖技术的基础上发展起来的，它的建立可为植物幼苗的工厂化生产打下基础。3.用植物组织细胞培养技术建立的

植物无性系的类型器官发生型(0rganogensis)类胚体发生型(Embryogensis)原球茎型(Protocorm)器官型(Organtype)不定芽型(Adventitousbudtype)从外植体诱导愈伤组织，经愈伤组织细胞的分化培养，可通过形成不定芽而再生成植株的方式。在不定芽上还能不断地诱导不定芽。器官发生型的特点：繁殖速度快，由于经愈伤组织而再生成植株，遗传性不稳定。优点：成苗数量大，对培养基要求不算高，容易调配。缺点：通过愈伤组织成苗，细胞的染色体容易发生数量和结构变异，很难使再生植株群体保持稳定的遗传性。

由植物器官、组织和细胞培养通过形成类胚体，再由类胚体经由球形期、心形期、鱼雷期、子叶期发育成成熟胚，由成熟胚再发育成植株的方式。在成熟的类胚体上还能继续不断地形成新的胚状体。类胚状体发生型的特点：遗传性一致，有些植物体细胞胚发生数量亦相当大。如胡萝卜1L培养基有10万个以上的胚状体。

对培养基要求高，器官发生条件苛刻。繁殖数量不如不定芽型和器官发生型多，但遗传性稳定。这种类型的组织细胞培养后可经原球茎分化而形成植株。原球茎发生型是兰属特有的器官发生方式。大部分兰花属于这一类型，形成原球茎后就能不断繁殖下去，这样就建立起了无性系。种子消毒后，在培养基上播种，经一段时间培养而发生原球茎(带芽)，然后由原球茎直接长成植株。培养离体的茎、花芽、叶、鳞片等外植体，诱导直接产生不定芽，再生成植株的方式。器官型特点：遗传性也比较稳定，但繁殖速度慢。对培养基要求高，器官发生条件苛刻。繁殖数量不如不定芽型和器官发生型多，但遗传性稳定。

诱导顶端分生组织分化产生不定芽，再生成小植株，再将小植株分段切取，每一段带一个芽。即选取已经发育成熟的顶芽和腋芽，连同它们的短枝经表面灭菌后，在无菌条件下培养，诱导不定芽并使其生根形成植株的方式。不定芽发生型的特点：不仅繁殖率高，可利用外植体原有的芽，包括隐芽在内,繁殖数量大，同时能保持该植物种的遗传稳定性。

容易成苗，对培养基要求不高，后代遗传性较为稳定，但取材受到一定限制，仅限于具有明显顶端分生组织和次生分生组织的物种。4.植物无性系的工厂化生产技术植物无性系的工厂化生产的主要程序为小型工厂的设计、用具的准备、生产方法的选择等。小型工厂由操作间、培养间、接种间、温室、贮藏间等组成。操作间用于培养基的制备（20～40㎡）；接种间用于无菌操作（8～16㎡）；培养间用于试管苗的生产（20～40㎡）；温室用于试管苗的锻炼及移栽（200～400㎡）。工厂化试管苗生产工艺流程图所选植株取带芽茎段材料消毒剪取单芽茎段无菌试管苗剪取单芽转接试管苗原种转接试管苗转接试管苗光培锻炼沙培锻炼营养钵苗圃一年生商品苗商品试管苗移出三、无病毒植物的培养植物受病毒危害是一个影响生产的严重问题。目前已发现的植物病毒种类不下500种，严重危害着农业生产。在果树、蔬菜、花卉、林木以及农作物上皆有发现。随着生产栽培时间的推移，危害越来越严重，发现的病毒种类也越来越多。许多栽培植物因为感病而严重减产，品质变劣。(一)脱除植物病毒的原理及方法茎尖培养脱毒法热处理脱毒法微体嫁接离体培养脱毒法珠心组织培养脱毒法1.茎尖培养脱毒法(1)茎尖培养脱除病毒的依据

病毒在植物体内分布是不均一的，越接近生长点，病毒浓度越稀，因此有可能采用小的茎尖离体培养而脱除植物病毒。康乃馨不同大小茎尖培养与康乃馨斑驳病毒的脱除情况茎尖大小培养数荆芥鉴定之病斑无病毒茎尖(mm)总病斑接种叶数每叶平均病斑数数目﹪0.133130.22660.2520137612.28400.53011987017.14130.7594291235.31111.044321139.2001.0以上519722098.600已知病毒是DNA大分子，病毒侵染植物后可进入植物细胞。当植物细胞分裂时，病毒DNA随着复制。因此，植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争，在迅速分裂的植物细胞中，是正常核蛋白合成占优势，而在植物细胞伸长期间，是病毒核蛋白合成占优势。生长点、分生组织细胞是活跃分裂的细胞，其分裂速度比病毒DNA复制速度快，故采用旺盛分裂的生长锥(顶端分生组织)离体培养，就有可能脱除植物病毒。(2)茎尖脱毒的原理(3)利用茎尖培养技术产生无病毒植株的优点有些病毒不能侵染种子，因此用种子繁殖能排除大多数病毒，达到复壮的目的。但有性过程不能维持无性繁殖作物种性，使用这—方法则受到了限制。利用茎尖分生组织培养是目前最有效的除去病毒的方法，几乎对所有病毒都有效，且周期短，效率高，还可与植物的快速繁殖相结合。

同一种病毒在不同植物体内分布部位不同。

不同病毒种类在同一种植物中分布部位不同。

茎尖越小对培养基的要求越高，成功率越低。病毒在植物不同种和品种茎尖中分布的部位及脱毒效果

植物种类病毒去除病毒茎尖大小(mm)品种数甘薯斑纹花叶病毒1.0～2.06缩叶花叶病毒1.0～2.01羽毛状花叶病毒0.3～1.02马铃薯马铃薯Y病毒1.0～3.01马铃薯X病毒0.2～0.57马铃薯卷叶病毒1.0～3.03马铃薯G病毒0.2～0.31马铃薯S病毒0.2以下5大丽菊花叶病毒0.6～1.01康乃馨花叶病毒0.2～0.85百合各种花叶病毒0.2～1.03鸢尾花叶病毒0.2～0.51大蒜花叶病毒0.3～1.01矮牵牛烟草花叶病毒0.1～0.36菊花花叶病毒0.2～1.03草莓各种花叶病毒0.2～1.04甘蔗花叶病毒0.7～8.012.热处理脱毒法(1)热处理脱毒法的依据和原理:

植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在着相互竞争，在旺盛分裂的细胞中是正常核蛋白合成占优势，而在细胞伸长期间是病毒蛋白的合成占优势。因此，加速分生组织细胞的分裂可以获得无病毒植株。病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后，随植物细胞的DNA一起复制。热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓增殖或增殖停止，而失去侵染的能力。

热处理是一种物理效应，与冷处理一样，它可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。(2)热处理脱除病毒的方法①愈伤组织热处理脱毒法

方法：从患病植株上取叶片(茎片、鳞片、花器亦可)进行离体培养，诱导形成愈伤组织，然后将愈伤组织反复继代培养同时兼用热处理。常用处理温度及处理时间：

温度：37～38℃时间：处理2周、4周或8周；

温度：50℃时间：3～15min。

反复继代兼热处理，经历一定的时间(继代次数需试验)后，将热处理过的愈伤组织转移到分化培养基中，诱导器官分化。愈伤组织继代兼热处理钝化TMV和CMV获得无病毒植株的效果

继代无烟草花叶病毒(TMV)无黄瓜花叶病毒(CMV)

次数25℃30℃37℃小计25℃30℃37℃小计00/20--0/208/21--8/21

10/200/200/200/605/184/1910/2119/58

20/200/200/200/608/2010/2011/2029/60

32/200/208/2010/6010/208/2011/2029/6040/200/205/205/6054/201/205/2010/60②热空气处理脱毒法

方法：将试验母株在高温生长室中生长一个阶段，使其顶端分生组织和次生分生组织迅速生长，然后切取其茎尖分生组织进行离体培养。生长室温度：35～40℃(注意逐渐升温)。光照强度：3000～100001x(因植物而异)。所脱除的病毒种类和处理温度的高低、处理时间长短也有密切关系。应注意病毒种类、处理温度、处理时间三者之间的协调关系。3.微体嫁接离体培养脱毒法(1)微体嫁接脱毒法的特点:

可以将极小的(﹤0.2mm)茎尖作为接穗嫁接到不带毒的种子实生苗砧木上。然后连同砧木一起在培养基上进行培养。接穗在砧木的哺育下很容易成活，故可用很小的茎尖来培养，消除病毒的几率大，获得无病毒苗的可能性大。(2)微体嫁接脱毒的方法

砧木(Goldendelicions)种子低温层积处理后灭菌，把种胚培养在MSA固体培养基上。在25℃黑暗条件下培养15d，使其发芽。

将MSA固体培养基中发芽的上胚轴切下(带2片子叶)，插入带滤纸桥的试管中，滤纸桥中间有孔，使上胚轴通过小孔而固定。试管中放的是MSB，适于茎尖(接穗)生长的液体培养基。

接穗(Griffith)用其0.2mm大小的茎尖分生组织进行嫁接。采用劈接法将接穗插入两片子叶中间的组织中。接穗在砧木的哺育下生长发育。苹果微体嫁接茎尖大小与脱毒成功率

茎尖大小嫁接茎尖嫁接成功茎尖嫁接成功率(mm)(个)(个)(％)茎原锥(0.08～0.03)20315茎原锥带2片叶原基(0.1～0.2)201365茎原锥带4片叶原基(0.3～0.4)201575茎原锥带6片叶原基(0.6～0.8)2018904.珠心组织培养脱毒法

有人认为病毒是通过维管组织传播的，而珠心组织与维管组织无直接联系，故可以通过珠心组织培养获得无病毒植株。(Millins（1976)报道，柑橘、葡萄通过珠心组织培养获得无病毒植株。(二)无病毒植物的鉴定1.血清鉴定法2.生物鉴定法(敏感植物鉴定法)3.电子显微镜鉴定法

血清鉴定法基本原理：利用抗原和抗体的特异性结合，用病毒作为抗原来免疫动物产生抗体（即抗血清），该抗血清只能结合该种病毒。因而利用抗原和抗体相结合的“血清反应”即可鉴定是否为无病毒植株。动物植物血清反应病毒感染人工注射异体蛋白（抗原）动物免疫球蛋白（抗体）带该种病毒（抗原）

＋玻璃片凝集法示意图植物汁液对照血清抗血清叶绿体发生典型凝集现象2.敏感植物鉴定法敏感植物的概念：

有些植物对病毒极为敏感，一旦感染病毒就会在其叶片乃至全株上表现特有的病斑，把这种植物称为病毒敏感植物或指示植物。敏感植物鉴定病毒的方法：

A.摩擦接种法

B.嫁接法3.电子显微镜鉴定法

用电镜直接观察经脱毒培养的叶片，检查是否有病毒质粒的存在，还可以测量病毒颗粒的大小、形状和结构。电镜鉴定法是—种既准确又科学的方法。茎尖脱毒培养过程三、植物细胞工程与种质保存(一)种质保存的发展概况:1.低温干燥法即减少植物种子含水量，同时利用低温干燥环境，来延长种子寿命的方法。该方法是目前保存种质最通用的方法。2.减压贮藏法降低氧压，以抑制种子呼吸来延长种子寿命。由于对贮藏设备要求太高，该方法尚未普遍推广。3.冷处理保存法利用冷处理(4℃左右)的方法，以降低植物细胞的代谢水平，来探索保存无病毒茎尖分生组织和愈伤组织。3.超低温冷冻保存种质超低温冷冻保存种质是指在干冰（-79℃）、超低温冰箱（-80℃）、液氮的气相（-140℃）或液态氮（-196℃）中保存组织和细胞。(二)超低温冷冻保存种质的优点在极低的温度下，细胞停止代谢和生长，也不会发生变异，因此其遗传特性可长期保存下来。超低温冷冻保存也不会丧失细胞的形态发生的潜能，因而特别适合各类植物（如珍贵植物和濒危植物的种质保存、杂交育种材料的保存等）的种质保存。利用超低温冷冻保存还可长期贮存脱毒的茎尖分生组织，用于远缘杂交的花粉、细胞系及花粉胚等。因此，超低温冷冻保存技术既可以节省人力、物力，又可为遗传育种工作提供性状稳定的材料。(三)超低温冷冻保存种质的原理

常用的冷冻防护剂均属于低分子量的中性物质，这类物质在水溶液中能强烈地结合水分子，水合作用的结果使溶液的黏度增加。当温度下降时，溶液冰点下降，即冰的结晶中心增长速度下降，使水的固化程度减弱。

冷冻防护剂的使用提高了培养基渗透压，导致细胞的轻微质壁分离，相对提高了组织和细胞的抗寒力。

二甲基亚砜除上述作用外，还极易渗入细胞内部，可防止细胞在冷冻和融冰时引起过度脱水而遭受破坏，起到保护细胞的作用。(四)超低温冷冻保存种质的方法

将离体培养的茎尖分生组织、愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体等，经冷冻防护剂处理，然后送入-196℃液氮超低温库内进行“超低温冷冻”保存。常用的冷冻防护剂种类有甘油、甘露醇、脯氨酸、二甲基亚砜(DMSO)。冷冻防护剂的使用浓度为5％〜10％。(五)超低温冷冻保存种质的程序预培养冷处理降温冷冻及超低温保存解冻再培养(1)预培养提高细胞抗寒力，培养时间3～4周。加速传代以提高分裂细胞的比例。用甘露醇、糖等提高培养基渗透压。加入脯氨酸或二甲基亚砜进行短期预冷处理。(2)冷处理

保存材料的温度必须降至O℃。

加入冷冻防护剂冷冻保护剂的作用：它们属于相对低分子质量的中性溶质，在溶液中以强烈地结合水分子，发生水合作用，使溶液中的黏性增加。DMSO易渗透到细胞内部，不会导致细胞在冷冻和融冰时因脱水过度受渗透冲击而损伤。(3)降温冷冻及超低温保存降温冷冻有预冻、慢速冷冻和快速冷冻三种方法。

预冻法：加入冷冻防护剂后，使温度下降-70℃～-20℃范围内进行预冷，然后再进入-196℃液氮库超低温冷冻保存。

慢速冷冻法：在加入冷冻防护剂后，逐渐降低温度，以每分钟下降1℃～-5℃的速度降低温度。待温度降到-40℃或-100℃时，平衡1h，即稳定1h。然后进入-196℃液氮低温库，超低温冷冻保存。

快速冷冻法：在0℃下加入冷冻防护剂二甲基亚砜后，直接进入-196℃液氮库。(4)解冻

采用迅速解冻法，在30～40℃下迅速解冻，以避免组织和细胞脱水死亡。(5)再培养

根据植物种类，提供和满足原来的培养条件进行培养，使细胞恢复分裂能力。诱导器官分化和植株再生，当然对于次生物质生产来讲，这一步是恢复高产细胞株的生化合成能力。四.细胞工程与植物次生

代谢产物的生产(一)利用植物细胞培养生产次生代谢产物的意义(二)利用植物组织细胞培养技术生产次生代谢产物的方法（一）利用植物组织培养生产次生代谢产物的意义

次生代谢产物的生产是在可控制的条件下进行的，因此可以通过改变培养条件来筛选新细胞系，得到超越整体植物产量的代谢产物，节约能源，减少占用耕地面积。

与植物栽培不同而与发酵工业相似，不受天气、地理、季节等外界环境因素的影响。而且培养细胞是在无菌条件下生长的，因此可以排除病菌和虫害的侵扰。

可以进行特定的生物转化反应。

可以探索新的合成路线的获得新的有用产物。目前已经对400多种植物进行过研究,从培养的植物细胞中分离到次生代谢产物有600多种，其中60多种在含量上超过或等于原植物,包括几十个类别，如核酸、蛋白质、酶类、多肽、糖类、脂肪、或单宁类物质、维生素、激素、各种植物碱、固醇、植物生长激素等。（二）利用植物组织细胞培养技术生产次生代谢物的方法1.高产的细胞株的选择:(1)适于大规模培养的细胞株有两个条件：

细胞的生长速度快;次生代谢物含量的积累较高。

(2)筛选细胞株的过程：

愈伤组织的诱导和培养:从高产株的产次生产物部位取出部分材料培养成愈伤组织。

单细胞的分离和细胞无性系的分离。

细胞株的筛选:对愈伤组织继代培养和进行各种化学分析，以确定次生代谢物的产量。待化学分析的结果明确后，将次生代谢物产量最高的细胞块再继代培养。2.扩大培养

将筛选到的优良细胞株经多次扩大繁殖,可培养出大量的细胞，以作为大规模细胞培养的原种。在培养过程中，要经常鉴定细胞株，并进行提纯，防止细胞株退化和变异。3.大量培养植物细胞大量培养系统可以分为固体培养和液体培养系统。通常使用的固体培养系统包括有利用琼脂作为支持物的琼脂培养和固定细胞。液体培养系统包括小规模的悬浮培养和大规模的成批培养、半连续培养和连续培养。植物基因工程的应用一、基因工程在植物育种中的应用二、基因工程与生物固氮三、利用植物作为生物反应器一、基因工程在育种中的应用(一)培育抗虫植物(二)培育抗病毒植物(三)培育抗除草剂作物(四)培育耐受环境压力和抗衰老的作物(五)改进农产品的品质(六)改变花卉颜色、花形和花期(七)植物杂种优势利用的基因工程(一)培育抗虫植物抗虫基因的种类：⑴细菌抗虫基因如Bt毒蛋白基因；⑵植物抗虫基因：豇豆胰蛋白酶抑制剂基因、马铃薯蛋白酶抑制剂-Ⅱ基因、α-淀粉酶抑制剂基因、外源凝集素基因。⑶其它抗虫基因：真菌的壳多糖酶基因、核糖体灭活蛋白（RIP）基因产物及一些昆虫的毒素基因都具有一定的抗虫作用(二)培育抗病毒植物⑴TMV外壳蛋白介导的抗性利用植物病毒外壳蛋白基因，培育抗病毒的转基因植物。⑵病毒复制酶介导的抗病毒作用

⑶卫星RNA介导的抗病毒作用(三)培育抗除草剂作物抗除草剂转基因策略：一是修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感，或导入靶蛋白基因使之过量表达以使植物吸收除草剂后仍能正常代谢；二是引入酶或酶系统，在除草剂发生作用前将其降解或解毒。(四)培育耐受环境压力和抗衰老的作物

抗旱作物基因工程

抗盐作物基因工程

抗寒作物基因工程

抗早熟作物基因工程

抗氧离子基团基因工程(五)改进农产品的品质1.改善脂肪酸的质量(1)导入硬脂酰ACP脱饱和酶的反义基因,增加饱和脂肪酸含量。(2)导入硬脂酰CoA脱饱和酶基因、油酰基-ACP硫酯酶基因、3-酮酯酰ACP合成酶基因等，降低饱和脂肪酸含量。2.提高种子蛋白的营养价值(1)改良种子贮藏蛋白营养品质：①修饰自身种子贮藏蛋白基因，从而改善其编码蛋白质的氨基酸组成；②把能编码一系列氨基酸序列的外源种子贮藏蛋白基因导入缺乏该氨基酸序列的种子植物；③利用人工合成的基因改善种子蛋白的含量。(2)改良影响面包烘烤质量的种子蛋白特性：①通过增加麦谷蛋白的HMW-亚基基因拷贝数来增加麦谷蛋白的含量；②引入具有超量Cys残基的HMW-亚基来产生高交联聚合物。3.延迟水果的成熟期(1)应用PG反义基因技术，抑制多聚半乳糖醛酸酶（PG酶）的活性，培育转基因番茄

(2)应用反义基因技术抑制植物体内乙烯的合成，延长水果的成熟期,通过干扰乙烯合成的关键酶ACC（氨基环丙烷酸）合成酶和ACC氧化酶的编码基因，培育转基因植物。4.修饰淀粉的成分淀粉合成途径中有三种关键酶—ADPG焦磷酸化酶（AGPP基因）、淀粉合成酶(颗粒凝结型淀粉合成酶GBSS、可溶性淀粉合成酶SSS）和分支酶（SBE）,其功能及表达活性与植物淀粉的结构和特性密切相关，因此，通过改变这三种酶的数量和性质，就可达到改变植物体中合成淀粉的结构与质量的目的。(六)改变花卉颜色、花形和花期利用基因工程的方法对黄酮类物质合成途径中的酶的基因进行操作，就可培育出具有独特色泽的花卉。经研究表明，同源异型基因表达的加强或减弱都可能会改变花的大小和形状，而它的表达时间则直接影响植物的花期。因此，可望在不久的将来通过转基因途径人工控制花形和花期。(七)植物杂种优势利用的基因工程显性核不育基因和育性恢复基因的基因工程

利用毒素基因的特异空间表达诱导雄性不育

通过抑制花药中类黄酮的生物合成诱导雄性不育

通过提前降低胼胝质含量诱导雄性不育

通过抑制花粉发育有关的基因诱导雄性不育

利用反义RNA技术创造雄性不育（二）基因工程与生物固氮

采用基因工程技术将固氮基因直接导入非豆科植物，特别是禾谷类农作物，将其转变为固氮作物。

采用基因工程技术，提高硝酸盐还原酶的催化活性，或是在体外修饰基因的表达信号，提高硝酸盐还原酶的水平，从而使植物使用硝酸盐的能力得到加强。（三）利用植物作为生物反应器1.利用植物生产糖类物质2.利用植物生产蛋白质和多肽3.利用植物生产可降解的生物塑料的原料三、分子标记及其在植物遗传

育种上的应用(一)遗传标记的概念(二)分子标记的种类、基本原理与特点(三)分子标记在植物遗传育种研究上的应用遗传标记的概念

遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。在现代遗传学中遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。遗传标记可以帮助人们更好地研究生物的遗传与变异规律。在遗传学研究中遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。在作物育种中通常将与育种目标紧密连锁的遗传标记用于对目标性状进行追踪选择。遗传标记的种类1.形态标记：指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、穗形、粒色等的相对差异。2.细胞学标记：指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体的结构和数量特征即常见的细胞学标记，它们分别反映了染色体结构上和数量上的遗传多态性。3.蛋白质标记：是根据蛋白质（酶蛋白）电泳谱带的不同来显示蛋白质（酶蛋白）在遗传上的多态性。4.DNA标记：DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映。DNA分子标记的优点(1)直接以DNA的形式表现，在生物体内的各个组织、各个发育时期都可检测到，不受季节、环境限制；(2)数量极多，遍及整个基因组；(3)多态性高，并且自然存在许多的等位变异，不需专门创造特殊的变异材料；(4)表现“中性”，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；(5)许多分子标记为共显性标记，能鉴别出纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息RFLP

RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）即限制性片段长度多态性。这种多态性是由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生突变引起的。RFLP标记具有共显性，信息完整、实验结果稳定可靠，重复性好的特点，特别适合于建立连锁图。但是，RFLP有以下不足：①对DNA多态性检出的灵敏度不高，RFLP连锁图上还有很多大的空间区（gap）；②RFLP检测步骤多、周期长、成本高，每次实验检测的位点少；③需用放射性同位素或非放射性物质标记探针，且探针的种属特异性较强。RAPD

RAPD（RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA）即随机扩增多态性DNA。RAPD技术建立在PCR（PolymeraseChainReaction）技术基础之上，它是利用一系列不同的寡聚核苷酸（通常为10碱基）为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物通过PAGE或琼脂糖凝胶电泳分离，经EB染色或放射自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性。这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。微卫星标记微卫星（Microsatellite）是指以少数几个核苷酸（多数为2～4个）为单位多次串连重复的DNA序列，也称之为简单序列重复（SimpleSequenceRepeats，SSR）或简单序列长度多态性（SimplesequenceLengthPolymorphism，SSLP）。

微卫星标记的最大优点在于它具有大量的等位差异，而这种变异在生物群体中是大量存在的，通过简单的PCR反应即可直接检测到已知的特定染色体位点。它具有一般PCR操作简单、快速、成本低的特点，又拥有RFLP稳定可靠，特异性强和共显性的优点。但是，微卫星标记必须依赖测序设计引物，引物的开发比较困难，所需技术复杂，周期长，费用高，对大多数物种来说现已发表的引物数目相当有限，难以满足各方面的需要。AFLP

AFLP即扩增片段长度多态性。AFLP是RFLP与PCR相结合的一种分子标记技术，其基本原理是对基因组DNA限制性酶切片段的选择性扩增，扩增片段通过高分辨率的测序分析胶（变性聚丙烯酰胺凝胶）进行电泳分离检测，DNA多态性即以扩增片段的长度和数量不同而被检测出来。AFLP是RFLP和PCR有机结合产生的一种分子标记技术，既有RFLP的可靠性，也具有PCR（如RAPD）的灵敏性，可产生丰富而稳定的遗传标记，快速高效。但是，AFLP主要属于显性标记，且操作比SSR和RAPD复杂，费用较高，还可能需要同位素或非同位素标记引物。遗传多样性研究

基因型不同的品种，或不同亲缘关系的物种，基因组内核苷酸序列存在差异。当使用同一随机引物对不