第2章 基因工程制药9,10,11,12,13节

第九节高密度发酵一、概述高密度发酵：培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L（细胞干重/L）以上，最高200gDCW/L外源基因表达产量与单位体积产量正相关；单位体积产量与细胞浓度和单个细胞平均表达产量正相关。高密度发酵是在单个细胞平均表达产量不变的前提下，通过单位体积的菌体数量的倍增，实现总表达量的提高。高密度发酵特点菌体高密度，总表达量高生物反应器体积小单位体积生产能力高生产周期短，分离成本小一、影响高密度发酵的因素1.培养基：C源、N源种类和含量；C:N含量比值；微量元素；无机盐（磷影响表达质粒的复制速率）2.溶氧浓度：空气分离系统提高氧分压；透明颤菌血红蛋白基因克隆到菌体中，提高氧传质能力；菌体与小球藻混合培养，藻细胞光合作用产氧供菌体呼吸。3.pH值：大肠杆菌产酸、CO2必须加碱调节pH值4.温度：控制菌体生长，温控诱导表达（诱导时机和持续时间，对数生长期，2min）5.代谢副产物：C源物质供应超过三羧酸循环或电子传递链能力，产生乙酸，抑制菌体生长和蛋白表达。采取流加补料法，或加入甘氨酸、甲硫氨酸抑制乙酸生成。二、实现高密度发酵的方法1.发酵条件的改进（1）培养基的选择：6g/L的甘油作碳源（缩短工程菌的利用时间），各组分浓度较普通提高2～3倍。（2）建立流加式培养方式：营养液（补料）分批维持菌体高生长速率时添加。补料分批发酵包括：反馈补料（恒速补料、变速补料、指数补料）；非反馈补料（恒溶氧法、pH法、菌体浓度反馈法）。（3）提高供氧能力：加压、纯氧、H2O2、提高氧传质能力等。2.构建产乙酸能力低的工程化宿主菌（1）阻断乙酸生产的主要途径：用基因敲除技术或基因突变技术使大肠杆菌的磷酸转乙酰酶（PTA）基因pta1和乙酸激酶(ACK)基因acka失活，使丙酮酸到乙酸的合成途径被中断。（2）对碳代谢流进行分流：丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶Ⅱ可将丙酮酸转成乙醇，毒性小于乙酸。（3）限制进入糖酵解途径的碳代谢流：用基因敲除技术将磷酸转移酶系统（PST）酶Ⅱ的ptsG基因破坏，降低葡萄糖的摄取速率。（4）引入血红蛋白基因：透明颤菌血红蛋白基因vgb导入大肠杆菌，提高氧传质能力，耐缺氧环境。3.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌rpoH基因编码大肠杆菌RNA聚合酶的r32亚基，r32亚基对多种蛋白水解酶的活力正调控。构建rpoH基因缺陷的突变株，降低蛋白水解酶的活力。第十节基因工程药物的分离纯化基因工程药物都是多肽或蛋白质，其特点为：①表达产物在初始物料中含量较低；②含有大量细胞及代谢产物、残留培养基、无机盐；③表达产物稳定性差，易失活、变性；④表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；⑤应用广，对其质量纯度要求高、无菌、无热源。一、建立分离纯化工艺的根据（各种因素）⒈含目的产物的起始物料的特点（上游过程的各种因素对分离、纯化工艺的影响）包括：①菌种的类型及其代谢特性、产物、副产物。②原材料和培养基的来源及其质量是否稳定。③生产工艺和条件。④初始物料的理化性质、生物学性质。⒉物料中杂质的种类和性质。⒊目的产物特性。⒋产品质量的要求二、分离纯化的基本过程

发酵液细胞分离胞内产物胞外产物

细胞破碎

固液分离

浓缩初步分离高度纯化制剂产品包含体细胞碎片分离变性复性三.细胞破碎

1.物理破碎法（1）高压匀浆法（2）高速珠磨法（3）超声破碎法（4）高压挤压法2.化学破碎法（1）渗透冲击（2）增溶法（3）脂溶法3.生物破碎法：酶溶法四.固液分离1.离心沉淀法2.膜过滤法3.双水相萃取五、重组蛋白的分离纯化技术①技术条件温和能保持产物生物活性。②选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。③收率要高。④两个技术间能直接衔接，不需要对物料加以处理。⑤纯化过程要快，满足高生产率的要求。目的产物的分离纯化蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。产物特性作用等电点决定离子交换种类及条件相对分子量选择不同孔径的介质疏水性与疏水、反相介质结合的程度生物特异性决定亲和配基溶解性决定分离体系及蛋白浓度稳定性决定工艺采用温度及流程时间产物的特性在分离纯化中的作用分离纯化的方法：色谱分离方法

⑴离子交换层析（ionexchangechromatography，IEC）离子交换层析的基本原理是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。它具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。

⑵反相色谱（reversedphasechromatography，RPC）和

疏水色谱（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。反相色谱是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相之间相互作用力的大小以及溶质分子中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小差异进行分离的。常用固定相为硅胶烷基键合相。流动相为低离子强度的酸性水溶液，加入能与水互溶的乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂。由于固定相骨架疏水性强，吸附的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱下来。疏水层析的原理与反相色谱的原理相似，主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。流动相为pH6～8盐水溶液。高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与介质的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时，蛋白质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱时间越长。与反相色谱相比，疏水层析回收率较高，蛋白质变性可能性小。⑶亲和层析（affinitychromatography，AC）亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。配基：在亲和层析中起可逆性结合的特异性物质。载体：与配基结合的支撑物。亲和层析可分三步：①配基固定化②吸附目的物③样品解吸⑷凝胶过滤层析凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异，可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。主要应用两个方面：

①脱盐和更换缓冲液②蛋白质分子的分级分离。在产品的形成阶段前用于除去产物的多聚体及降解产物。六、非蛋白质类杂质的去除⑴

DNA的去除：DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。⑵热原质的去除：热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖Gˉ菌细胞壁成分）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。⑶病毒的去除：层析或过滤可将病毒去除,紫外线照射使病毒失活。七、选择分离纯化方法的依据⒈根据产物表达形式来选择分泌型表达产物的发酵液体积很大但浓度较低，纯化前必须浓缩，可用沉淀和超滤法。可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法，或离子交换层析。

产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式,它可以避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质,在一定程度上有利于分离纯化。为了获得周质蛋白，经低浓度溶菌酶处理后,可采用渗透压休克的方法来获得。⒉根据分离单元之间的衔接选择应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺，尽早采用高效的分离手段。先将最多的杂质去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段。即通常先运用非特异、低分辨的操作单元（如沉淀超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要杂质（包括非蛋白类杂质）。随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和亲和层析）凝胶过滤放在最后，这样可以提高分离效果。层析分离次序的选择同样重要，合理的组合能提高分辨效率，并有利于各步骤间的过渡。如离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤色谱。⒊根据分离纯化工艺的要求来选择分离纯化工艺应遵循以下原则：⑴具有良好的稳定性和重复性⑵尽可能减少组成工艺的步骤⑶各技术步骤间要相互适应和协调⑷工艺过程中尽可能少用试剂⑸工艺所用时间要短⑹工艺和技术必须收率高、易操作、能耗低⑺具有较高的安全性第十一节变性蛋白的复性一、包含体形成的原因：在高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过蛋白正确折叠的速率就形成包含体；重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏一些折叠酶和分子伴侣形成包含体。二、包含体的分离和溶解

1.包含体的分离：重组菌破碎、洗涤，蔗糖密度梯度离心法纯化2.包含体的溶解：用强变性剂（盐酸胍、脲）或去垢剂（SDS）三、包含体蛋白复性方法

1.稀释、透析复性法2.含二硫键的蛋白的复性3.封闭蛋白的疏水簇促进复性4.凝胶过滤层析复性5.小分子添加剂促进的复性6.折叠酶或分子伴侣促进的复性7.人工分子伴侣促进的复性第十二节基因工程药物的质量控制基因工程药物是利用活细胞作为表达系统，产物的分子量较大，并有复杂的结构。参与生理功能的调节，用量极微。宿主细胞中表达的外源基因，在转录、翻译、精制、工艺放大过程中可能发生变化，故从原料以及制备全过程都必须严格控制条件和鉴定质量。《中国生物制品规程》中国生物制品标准化委员会，2000，10，1执行。一、医药生物技术产品质量保证的一般要点1.产品安全性评价2.产品本身的结构3.严格控制条件二、原材料的质量控制确保编码药品的DNA序列的正确性重组微生物来自单一克隆所用质粒纯而稳定保证产品质量的安全性和一致性。

根据质量控制要求应了解以下特性：⒈目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列予以确证；⒉表达载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分（如复制子、启动子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记物；⒊宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性；⒋须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；⒌提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平。三、培养过程的质量控制在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含有致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定最高允许传种代数；在培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；依宿主细胞-载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品。培养周期结束时，应监测宿主细胞-载体系统的特性，例如：质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含插入基因载体的酶切图谱等。

四、纯化工艺过程的质量控制产品要有足够的生理