第七节-维生素的测定

第七节维生素的测定第一食品中的维生素及测定意义

第二脂溶性维生素的测定

第三水溶性维生素的测定重点掌握脂溶性维生素的测定（维生素A的测定），水溶性维生素的测定（维生素C的测定）的操作知识。了解维生素的概念，各类维生素的性质及生理功能和相关知识第一食品中的维生素及测定意义一、概念：维生素：指维持人体正常生命活动所必需的一类天然的有机化合物。其种类很多，被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各异，有的属于醇类，有的属于胺类，有的属于酯类，还有的属于酚或醌类化台物。二、维生素的特性：1、维生素或其前体化合物都在天然食物中存在；2、不能供给机体热能，也不是构成组织的基本原料；3、主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量极小；4、一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；5、长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。三、维生素的种类：1.根据其化学性质、结构：胺类、醛类、醇类、酚式、醌类等。2.根据其物理性质（溶解性）可分为：(1)脂溶性维生素：维生素A、维生素D、维生素K、维生素E。(2)水溶性维生素：维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素P、维生素PP。四、测定维生素的意义有助于评价食品的营养价值，开发利用富含维生素的食品资源2.指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症3.研究维生素在食品加工、贮藏等过程中的稳定性，指导人们制定合理的工艺条件及贮存条件，最大限度地保留各种维生素4.监督维生素强化食品的强化剂量五、维生素的分析方法

它们由植物合成并且通常以微量存与植物体中。如果植物组织中的蛋白质，脂肪和碳水化合物的含量是百分之几，那么维生素的量只能以百分之零点几甚至更小来计算。这就要求对植物中维生素的测定方法既要具有特别高的灵敏度又要有足够的精确度。

维生素分析的方法有化学法、仪器法、微生物法和生物鉴定法。测定方法比较:

第二脂溶性维生素的测定

一、脂溶性维生素的理化性质：1．溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。2．耐酸碱性：VA、VD对酸不稳定，VE对酸稳定。VA、VD对碱稳定，VE对碱不稳定。3．耐热性、耐氧化性：VA、VD、VE耐热性好，VA易被氧化，光、热促进其氧化；VD不易被氧化；VE在空气中能慢慢被氧化，光、热、碱能促进其氧化作用。结论：在测定维生素时，要根据其性质控制好测定条件。

二、脂溶性维生素的测定步骤（一）用皂化法处理样品，水洗去除类脂物。（二）用有机溶剂提取脂溶性维生素。（三）浓缩后溶于适当的溶剂后测定。三维生素A的测定

维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不合VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA，故称为VA原。维生素A：由β－紫罗酮环与不饱和一元醇所组成的一类化合物及其衍生物的总称。包括A1和A2。维生素A1：视黄醇，有多种异构体，可转化成多种衍生物。类视黄素：维生素A2（3-脱氢视黄醇）、视黄醛、视黄酸、3-脱氢视黄醛、3-脱氢视黄酸是维生素A1的衍生物，具有维生素A同样的作用，总称为类视黄素。（一）紫外分光光度法1．原理维生素A的异丙醇溶液在325nm波长下有最大吸收峰，其吸光度与维生素A的含量成正比。2．适用范围及特点灵敏度较比色法高，可测定维生素A含量低于5ug／g的样品。但在维生素A最大吸收波长325nm附近许多其他化合物也有吸收。本法适用于透明色油，维生素A的浓缩物等纯度较高的样品。3．试剂①维生素A标准溶液视黄醇85%（或视黄醇乙酸脂90%）经皂化处理后使用。称取一定量的标准品，用脱醛乙醇溶解使其浓度大约为1mg/mL。临用前需进行标定。取标定后的维生素A标准溶液配制成10I.U/mL的标准使用液。

标定：取VA溶液若干微升，用脱醛乙醇稀释3.00mL，在325nm处测定吸光度，用此吸光度计算出VA的浓度。

A13.00C=—×———×——————E100S×10C——VA的浓度g/mLA——VA的平均吸光度值

S——加入的VA溶液量uLE——1%VA的比吸光系数：1835②无水脱醛乙醇：取2g硝酸银溶入少量水中。取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入盛有1L乙醇的试剂瓶中，振摇后，暗处放置两天（不时摇动促进反应）。取上层清液蒸馏，弃去初馏液50mL.③酚酞：用95%乙醇配制成1%的溶液。④1:1氢氧化钾，0.5mol/L氢氧化钾。⑤无水乙醚（不含过氧化物）⑥异丙醇4.仪器：紫外分光光度计5.测定方法①标准曲线绘制：制备标准系列使用液→以空白液调仪器零点→在325nm波长下测定吸光度→绘制标准曲线分别取维生素A标准溶液(每毫升含10I．U)0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，于10毫升棕色容量瓶中，用异丙醇定容。②样品处理皂化：称取0.5-5g充分混匀的样品于三角瓶中，加入10mL1:1氢氧化钾及20-40mL乙醇，在电热板上回流30min。加入10mL水，稍稍振摇，若有混浊现象，表示皂化完全。提取：将皂化液移入分液漏斗，先用30mL水分两次洗涤皂化瓶（若有渣，可用经过脱脂棉过滤），再用50mL乙醚分两次洗涤皂化瓶，所有洗液并入分液漏斗中，振摇两分钟（注意放气），静止分层后，水层放入第二分液漏斗。皂化瓶再用30mL乙醚分两次洗涤，洗液倒入第二分液漏斗，振摇后静止分层，将水层放入第三分液漏斗，醚层并入第一分液漏斗。重复操作3次。洗涤：向第一分液漏斗的醚液中加入30mL水，轻轻振摇，静止分层后放出水层。再加15-20mL0.5mol/L的氢氧化钾溶液，轻轻振摇，静止分层后放出碱液。再用水同样操作至洗液不使酚酞变红为止。醚液静止10-20min后，小心放掉析出的水。浓缩：将醚液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约25mL乙醚洗涤分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶中。用水浴蒸馏回收乙醚，待瓶中剩余约5mL乙醚时取下减压抽干，立即用异丙醇溶解并移入50mL容量瓶中用异丙醇定容③样品测定：取浓缩后的定容液于紫外分光光度计上在325nm处测定吸光度，通过此吸光度从标准曲线上查出VA的含量。6.结果计算c——由标准曲线查得维生素A含量，I.U／mLm——样品重量，g。V——样品提取后加入异丙醇定容之体积，mL

（二）高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography)

HPLC法测定VA和VE含量1原理试样中的VA及VE经皂化处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用HPLC反相柱（RP-C18），将VA和VE分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。2步骤1）绘制标准曲线①维生素A和维生素E标准溶液的标定②标准曲线的绘制③HPLC分析色谱条件的选择：ODS柱，流动相（甲醇+水=98+2），紫外检测波长300nm，进样量20μL，1.7ml/min。2步骤

2）样品处理皂化：称取1-10g样品于皂化瓶中，加入30mL无水乙醇，搅拌均匀。加入5ml10%抗坏血酸、苯并[e]芘标准液2ml，混匀，加10ml氢氧化钾溶液（1+1），混匀。于沸水浴中回流30min，使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。提取：将皂化液移入分液漏斗，先用50mL水分两次洗涤皂化瓶（若有渣，可用经过脱脂棉过滤），再用100mL乙醚分两次洗涤皂化瓶，所有洗液并入分液漏斗中，振摇2min（注意放气），静止分层，弃去水层。洗涤：用约50ml水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸检验直至水层不显碱性（最初水洗轻摇，逐次振摇强度增加）。浓缩：将醚液经过无水硫酸钠滤入与旋转蒸发器配套的250~300ml球形蒸发瓶中，用约100mL乙醚洗涤分液漏斗和无水硫酸钠3次，洗液并入蒸发瓶中。旋蒸回收乙醚，待瓶中剩余约2mL乙醚时取下，氮气吹干，立即加入2ml乙醇，混匀，溶解。将乙醇液移入一小离心管中离心5min。上清液供色谱分析。3计算

X=(c/m)×V×(100/1000)X—维生素含量，mg/ml；c—由标准曲线查到的某种维生素的含量，μg/ml；m—试样质量，g；V—试样浓缩定容体积，ml。

（三）三氯化锑比色法l．原理在氯仿溶液中，维生素A与三氯化锑可相互作用，生成蓝色可溶性配合物，其颜色深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比。该物质在620nm波长处有最大吸收峰，其吸光度与维生素A的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。

2．适用范围适用于维生素D含量较高的各种样品(高于5—10ug／g)。3．仪器分光光度计4．试剂①无水硫酸钠：不吸附维生素②乙酸酐③无水乙醚：不含过氧化物④无水乙醇：不含醛类物质⑤三氯甲烷：不含分解物⑥25％三氯化锑—三氯甲烷溶液⑦1:1氢氧化钾溶液：50gKOH溶于50mL水中。⑧0.5moL/L氢氧化钾溶液⑨维生素A标准溶液5．测定方法样品处理：除去脂肪，使维生素A从脂肪中分离出来①皂化：通过皂化得到一部分皂化物和一部分不皂化物从而把维生素和脂肪分开。皂化条件：C2H3OH︰脂类=8︰1；KOH量=脂量×皂化价（mg）×2.5；

皂化温度与时间：70℃、30分钟（至皂化瓶中加水不浑浊）称取0.5-5g→捣碎或混匀→加入l0mL1：1氢氧化钾及20-40ml乙醇→加热回流30分钟→皂化完全加入10m1水，稍稍振摇，若无混浊现象，表示皂化完全。②提取：水提取皂化物、乙醚萃取不皂化物皂化液移入分液漏斗→用30ml水分两次冲洗皂化瓶→用50m1乙醚分两次冲洗皂化瓶→洗液并入分液漏斗→水层放入第二分液漏斗→再用30m1乙醚分两次冲洗皂化瓶→洗液倾入第二分液漏斗→水层放入第三分液漏斗→醚层并入第一分液漏斗→如此重复操作，直到醚层不再使三氯化锑-三氯甲烷溶液呈兰色为止。③洗涤：水提取皂化物、碱液提取醚溶性酸皂

在第一分液漏斗中→加入30ml水→分层后弃去水层→加入15—20ml0.5moL／L的氢氧化钾溶液→弃去下层碱液→用水洗涤，至水洗液不再使酚酞变红为止→醚液静置l0—20分钟后，小心放掉析出的水。④浓缩：水浴蒸馏，回收乙醚，浓缩至瓶中剩约5m1乙醚。将醚液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中→用约25m1乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶内→水浴蒸馏，回收乙醚→减压抽干，立即准确加入一定量三氯甲烷(约5m1左右)，使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内(3—5ug／m1)。(2)标准曲线的绘制

以维生素A含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制曲线。取6个3cm比色杯顺次移入标准系列使用液各1m1，每个杯中加乙酸酐l滴，在620nm波长处，以l0mL三氯甲烷加1滴乙酸酐。制备标准系列使用液→制成标准比色系列→调节光度法零点→将标准比色系列按顺序移到光路前，迅速加入9mL三氯化锑一三氯甲烷溶液，于6s内测定吸光度(每支比色杯都在临测前加入显色剂)。准确吸取维生素A标准溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL于6个10mL容量瓶中，用三氯甲烷定容(3)样品测定测定样品空白液和样品溶液的吸光度，从标准曲线中查出相应的维生素A含量。取二个3cm比色杯，分别加入1mL三氯甲烷(样品空白液)和1mL样品溶液，各加1滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线的制备。分别测定样品空白液和样品溶液的吸光度，从标准曲线中查出相应的维生素A含量。6．结果计算

C——由标准曲线上查得样品溶液中维生素A的含量，ug/mLC0——由标准曲线上查得样品空白液中维生素A的含量，ug/mLm——样品质量，gV——样品提取后加入三氯甲烷定容之体积，mL100/1000——将样品中维生素A是由ug／g折算成mg／100g的折算系数如按国际单位，每1国际单位＝0.3ug维生素A。7说明及讨论

①维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或使用棕色玻璃仪器。并且在6min中内完成标准样品及待测样品的测定。②乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在提取、洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可加几滴乙醇破乳。③所用氯仿中不应含有水分，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰比色测定。故在每毫升氯仿中应加入乙酸酐1滴，以保证脱水。另外，由于三氯化锑遇水生成白色沉淀，因此用过的仪器要用稀盐酸浸泡后再清洗。④由于三氯化锑与维生素A所产生的蓝色物质很不稳定，通常生成6S后便开始比色，因此要求反应在比色管中进行，产生蓝色后立即读取吸光度。⑤如果样品中含β-胡萝卜素（如奶粉、禽蛋等食品）干扰测定，可将浓缩蒸干的样品用正己烷溶解，以氧化铝为吸附剂，丙酮、乙烷混合液为洗脱剂进行柱层析。⑥比色法除用三氯化锑做显色剂外，还可用三氟乙酸、三氯乙酸做显色剂。其中三氟乙酸没有遇水发生沉淀而使溶液混浊的缺点。四VD的测定—三氯化锑比色法（AOAC法）

1原理

在三氯甲烷溶液中，VD与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物，呈色强度与VD的含量成正比。与三氯化锑可生成橙黄色化合物，在500nm波长处有最大吸收峰。2操作步骤

（1）样品处理①分离柱的制备。②纯化。（2）测定①标准曲线的绘制。②样品测定。无水硫酸钠硅藻土中性氧化铝无水硫酸钠3计算

ρ×V

X=

—————×100

m×1000X——样品中VD的含量，mg／100g；

ρ——标准曲线上查得样品溶液中VD的含量μg/mL；(如按国际单位，每国际单位＝0.025μg维生素D)；

V——样品提取后用三氯甲烷定容之体积，mL；

m——样品质量，g。4说明及注意事项1）食品中VD的含量一般很低，而VA、VE、胆固醇、甾醇等成分的含量往往都大大超过VD、严重干扰VD的测定，因此测定前必须经柱层析除去这些干扰成分。2）操作时加入乙酰氯可以消除温度的影响，可使灵敏度比仅用三氯化锑提高约3倍，并可减少部分甾醇的干忧。3）此法不能区分维生素D2和维生素D3，测定值是两者的总量。第三水溶性维生索的测定一、水溶性维生素的性质易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂；在酸性介质中很稳定；在碱性介质中不稳定，易于分解；易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响，维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。二、测定水溶性维生素时的前处理方法（一）维生素Bl、B2通常采用盐酸水解，或再经淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用，使结合态维生素游离出来，再将它们从食物中提取出来。（二）维生素C通常采用草酸、草酸—醋酸、偏磷酸—醋酸溶液直接提取。三、维生素C的测定（一）概述：结构及化学性质：2.生理功能及在食品工业上应用(1)参与神经介质、激素的生物合成(2)是一种营养添加剂、强化剂、抗氧化剂。（二）2，6一二氯靛酚滴定法1.原理1）还原型Vc能定量地还原2、6-二氯靛酚（染料）2）2、6-二氯靛酚在中性或碱性溶液中显蓝色，在酸性溶液中显粉红色；被还原后不显色。还原型Vc+染料（显色）→氧化型Vc+被还原的染料（不显色）2.仪器(1)组织捣碎机。(2)25mL、10mL滴定管。(3)100ml具塞量简。

3.试剂(1)20g/L草酸溶液。(2)10g／L草酸溶液。(3)淀粉指示剂：取1g可溶性淀粉，加10mL冷水调成稀粉浆，倒入正在沸腾的100ml水中，搅拌至透明，放冷备用。(4)60g/L碘化钾溶液。(5)0.1000mol／LKIO3标准溶液：称取3.5670g经烘干的基准碘酸钾，溶解定容1L。(6)0.00lmol/LKIO3标准溶液。

(7)维生素C标准贮备液；称取纯L-抗坏血酸粉末20mg，用10g/L草酸溶解，定容100