第四章 灭活剂和佐剂 wang

第四章灭活剂和佐剂第一节灭活剂灭活是生物制品中的一项非常基本技术！！！提高生物制品的安全性防止病原体扩散一、灭活与灭活剂（一）什么是灭活？微生物学意义上灭活有两层含义：1、是指破坏或杀死微生物使其成为没有生命物质的过程。2、生物制品上的灭活还有灭能的含义，是指将一些活性物质（微生物及其代谢产物、激素、酶、血清因子和抗体等）丧失活力的过程。例如：经过56度加热30分钟处理，可破坏诊断血清和待检血清中的补体活性，从而避免补体对诊断的干扰作用。生物制品意义上灭活的含义：是利用物理或化学的方法，破坏微生物的生物学活性，破坏病原微生物的繁殖能力和致病能力，但仍然保留反应原性和免疫原性的过程。（二）灭活的类型按照灭活作用的性质可分为两类：1.物理灭活2.化学灭活1、物理灭活热灭活：容易发生菌体蛋白质变性超声波灭活：应放在冰浴中间断进行紫外线灭活：不够好射线照射灭活：根据被照射物的容量大小选择照射距离和照射强度。2、化学灭活利用化学药品等使微生物、活性物质的某些某些结构位点发生改变，从而丧失生命力、感染性、毒性或活性。效能常受灭火剂种类、剂量和作用温度、pH、时间等因素的影响，使用时必须筛选最佳的灭活条件。方法简单、效果确实、最为常用。（三）灭活剂用于灭活微生物的化学试剂或药物1911年，LowensteinDH用甲醛处理破伤风毒素而制成类毒素1924年，Puntoni以苯酚或甲醛处理制成犬瘟灭活苗1934年，MorionDorset等用结晶紫灭活猪瘟病毒制成猪瘟结晶紫疫苗。是最古典、使用最广泛的灭活剂《兽医生物制品制造及检验规程》（2000）中的26种灭活疫苗，均以甲醛作为灭火剂。二、常用灭活剂的灭活机理与应用1、甲醛甲醛的水溶液——福尔马林(含甲醛36~40%)

灭活机理：还原作用

氨基甲基胺

羧基亚甲基二醇单酯

巯基亚甲基二醇

甲醛醛基

羟基羟基甲酚灭活浓度：需氧细菌0.1％～0.2％，厌氧细菌0.4％～0.5％，病毒0.05％～0.4％。

灭活原则：低浓度、短时间而又能达到彻底灭活目的。必要时可在灭活后加入焦亚硫酸钠，以中断其反应。N-乙酰乙烯亚胺（AEI)、二乙烯亚胺(BEI)、缩水甘油醛（GDA）灭活机制：

1.烷化DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤等，引起单链断裂或双螺旋链交联，因改变DNA的结构而破坏其功能，妨碍RNA的合成，从而抑制细胞的有丝分裂。

2.与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。2.烷化剂（Alkylatingagent）优点：能破坏病毒的核酸芯髓，使病毒完全丧失感染力，而不损害其蛋白衣壳，保留其保护性抗原。

（1）N-乙酰乙烯亚胺（AEI）淡黄色澄明液体，有轻微氨臭味，能与水或醇任意混合。0～4℃可保存1年，在-20℃可保存2年。AEI功能基团是乙烯亚胺基，可用于口蹄疫灭活苗。口蹄疫病毒液:终浓度0.05％，30℃8h,加2％硫代硫酸钠阻断（2）二乙烯亚胺（BEI）市购商品为0.2％的BEI溶液，在0～4℃可保存1个月;口蹄疫病毒悬液：终浓度0.02%,加入2％硫代硫酸钠中断灭活。大肠杆菌、噬菌体、新城疫病毒灭活效果优于甲醛。本品易挥发，水溶液含量为15～31mg/ml。0～4℃保存3个月后含量渐下降，约半年失效；20℃只能保存10d。

（3）缩水甘油醛（GDA）3.苯酚又称石碳酸。有腐蚀性，而且有毒！易溶于水及有机溶剂。灭活机制：使微生物蛋白质变性和抑制如脱氨酶、氧化酶等酶系统的活性，从而导致微生物死亡。通常：生物制品的常用量为0.3%-0.5%,另外，芽孢、真菌和病毒对苯酚的耐受性很强。4.结晶紫是甲基紫、龙胆紫的纯品。灭活机制：是结晶紫阳离子与微生物蛋白质带阴性电荷的羧基形成弱电离的化合物，从而干扰微生物正常代谢和氧化还原作用，主要干扰细胞壁肽聚糖的合成，导致革兰氏阳性菌生长繁殖受阻。5.β-丙内酯又名丙内酯。灭活机制：破坏病毒的核酸芯，但不损坏衣壳蛋白，因此保护性抗原成分得以保留，主要用于狂犬病灭活苗的制备。然而研究表明，丙内酯是一种潜在的致癌因子。6.硫柳汞常用做生物制品的防霉和消毒剂，对霉菌、细菌和病毒都有一定的灭活作用，百日咳菌苗作为灭火剂。常用浓度为0.01%-0.02%。1、灭活剂特异性：如石炭酸对真菌和病毒效果差，但对细菌效果好。结晶紫能杀死多种革兰氏阳性菌和阴性菌，但对绿脓杆菌和细胞芽孢作用弱。2、微生物种类和特性：三、影响灭活作用的因素3、灭活剂浓度（一定要适合）4、灭活温度：通常同一浓度的灭活剂在不同温度的灭活速度与温度成正比，但温度太高，对微生物的抗原性将有不利影响。（具体不同病原体或毒素，其灭活时间和温度不一致）。5、灭活时间：一般采用低浓度、低温和短时间处理为最佳。6、灭活pH值：7、微生物含氮量：一般微生物或毒素的总氮量和氨基氮含量越高，灭活剂的消耗量就越大、灭活脱毒越慢。8、有机物存在：第二节佐剂佐剂是免疫学和生物制品学中的一个重要内容对增强机体对抗原的免疫应答，提高生物制品的免疫效应发挥着重要作用什么是“佐剂”呢？1.佐剂（新概念）：凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质均称为佐剂。

佐剂（旧概念）：当一种物质先于抗原或与抗原混合或同时注射于动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答,发挥其辅佐作用的物质。也称免疫佐剂、抗原佐剂。注意:佐剂和免疫增强剂的关系?一、佐剂概念与作用特点①明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产生特异性免疫应答。②用最少的抗原和最少的接种次数，产生足够的免疫应答。作用特点：二、研究历史1、起始阶段1916年Moignar最早用羊毛脂与石蜡油制成伤寒沙门氏菌乳剂苗；继后Prevet用羊毛脂加琼脂为佐剂制出炭疽菌苗。1925年，GastonRamon证明了明矾的佐剂作用。2、1950年代为提高兽医生物制品的免疫效果，在兽医领域对佐剂进行了广泛的研究。用氢氧化铝胶吸附再加油佐剂制成的猪丹毒菌苗，免疫乳猪后的免疫力可持续9个月，比铝胶佐剂苗提高1倍。3、1960年代以后矿物油佐剂的研究发展迅速布氏杆菌油佐剂苗（1966）魏氏梭菌油佐剂苗（1966）流感油乳剂苗（1977））禽支原体+新城疫油乳剂二联（1978）链球菌+葡萄球菌乳剂二联苗（1984）4、我国的佐剂的研究佐剂的研究和佐剂苗的生产，始于1950年代。1958年曾用羊毛脂和液体石蜡油制造猪丹毒油乳剂苗，但效果不理想。1980年代以来，对白油佐剂的研究和应用发展极快，尤以禽病白油佐剂疫苗的种类更多，使用效果也比较满意。WHO认为佐剂除具有免疫增强效应外，尚必须具备下列标准，否则不得用作佐剂。三、佐剂标准1、无致癌或辅助致癌性不能诱导或促进肿瘤形成。2、安全无毒性通过肌肉、皮下、静脉、腹腔、滴鼻、口服等各种途径进入动物体后无任何副作用。3、纯度高、杂质少杂质往往是副作用的诱发物。因此，佐剂必需符合质量标准。4、应有一定的吸附力最好吸附力强5、在动物体内易降解不宜长时期留存而诱发组织损伤6、不含与动物有交叉的抗原以避免诱发自身免疫反应，防止发生自身免疫性疾病。7、不应诱发自身超敏性也不应与抗体结合形成有害的免疫复合物。8、应性质稳定佐剂抗原混合物储存1年以上，必须不分解、不变质和不产生不良物质。四、免疫佐剂作用机理①改变正常免疫机能，吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原；②改变抗原的构型，使抗原物质降解，并加强其免疫原性；③延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释，并发挥免疫系统的细胞间协同作用（巨噬细胞与T细胞，T细胞与B细胞）。

作用方式①抗原递呈（antigenpresentation）②抗原寻的（antigentargeting）③免疫调节（immunemodulation）

作用机理①抗原递呈：指抗原分子递呈给T细胞的方法。佐剂与疫苗联合使用，有助于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分子特异性的结合、保护、运输并递呈给效应细胞。②抗原寻的（antigentargeting）指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原与细胞受体的结合等。③免疫调节（immunemodulation）

是指任何可以修饰的免疫效应细胞对抗原或表位进行加工的机制。通过这种机制，可以改变特异性免疫应答的本质或强度。T细胞有Th1和Th2两个亚类。同一抗原和不同佐剂一起使用能够引起不同的免疫反应。因此，通过筛选特定的佐剂，可以达到诱导正确的免疫应答的目的。1.按佐剂物理性质颗粒型佐剂非颗粒型佐剂2.按佐剂的生物学性质（即Ballanti分类法）微生物及其组分佐剂非微生物物质佐剂3.按佐剂在体内存留的时间贮存型佐剂（depottypeadjuvant）非贮存型佐剂（non-depottypeadjuvant）五、佐剂的分类六、常见的兽用免疫佐剂1、矿物质类佐剂矿物质佐剂是传统佐剂中的一类。

在兽用疫苗的制备中广泛使用。氢氧化铝胶磷酸铝胶特点

•主要诱导体液免疫应答，可刺激机体迅速产生持久的高抗体水平。•比较安全。缺点

•皮下注射时常有肿胀或结块；•不能有效刺激保护性T细胞免疫。2、油类佐剂主要有弗氏佐剂弗氏不完全佐剂弗氏完全佐剂白油佐剂是指一类由油类物质、水溶液和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。该类佐剂主要在抗原寻的过程中起作用，使抗原在注射部位保持稳定，为抗原在淋巴系统中转运提供载体，增加单核细胞的形成和积聚。油乳剂疫苗的免疫效力高低，直接与乳化作用的好坏及油、乳化剂质量有关。

油乳佐剂分为单相乳化佐剂双相乳化佐剂单相乳化佐剂（1）油包水（

W/O）较粘稠，在机体内不易分散；但佐剂活性优良，为生物制品所采用的主要剂型（2）水包油（O/W）较稀薄，在机体内易于分散；但佐剂活性很低，生物制品中不采用。双相乳化佐剂又分为水包油包水和油包水包油型粘度小，注射局部反应轻微，易吸收和佐剂效应高一种液体或粉末微粒（分散相或内相）借助乳化剂、机械力的作用，分散悬浮于另一种不相溶的液体（连续相或外相）中从而形成稳定的分散体系。油乳佐剂原理乳化剂

指油乳剂中内相与外相间的界面活性物质，具有促进和稳定两种互不相溶物形成乳剂。如羊毛脂、Span-80、Arlacel-80、Tween-80、AtlsG-1471等。乳化原理降低分散物的表面张力，在微滴表面上形成薄膜或双片层，以阻止微滴(粒)的相互凝结。佛氏不完全佐剂

是由低引力和低粘度的矿物油及乳化剂组成的一种贮藏性佐剂。佛氏完全佐剂在不完全佐剂的基础上加一定量的分支杆菌而成。虽然具有一定的副作用，但其佐剂活性是其它物质难于相比的。佛氏佐剂的特点可使在正常状态下缺乏免疫原性的物质成为免疫原。先作用于Th1细胞，后是Th2细胞，并能启动细胞免疫而发挥作用。国外常用白油：Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-4国内常用白油：7号或10号白油质量标准:

无色无味；

50℃运动粘度7m2／s左右；紫外吸收值（250-350）＜0.1％，紫外消光系数＜12×108；单环芳烃与双环芳烃含量低于0.5％，无多环芳烃；小鼠腹腔注射0.5ml观察160d或家免皮下注射2.0ml白油观察60d，表现正常。白油佐剂（1）剂在水中法：将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生成O/W乳剂。若欲得W/O型，可继续加入油，直到发生变型。该法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅拌而得到较好的乳剂。油乳佐剂乳化方法（2）剂在油中法：将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，继续加入至变型。该法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在0.5µm左右，比较稳定。免疫实验动物用的佐剂配制:

(1)弗氏佐剂：矿物油75%~85％，乳化剂15％~25%，混合后经除菌过滤而成为FIA；如向其中加入0.5mg／m1死结核杆菌即为FCA。使用时，将含抗原的水相，与上述任一佐剂等量混合，用力振摇即可成为均匀的乳剂。(2)白油佐剂