高效液相色谱分析方法的建立

1.反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析方法的建立

2.液相色谱常见问题及处理方法

3.色谱联用技术（LC-MS）

4.制备液相色谱技术反相高效液相色谱（RP-HPLC）

分析方法的建立什么是色谱？色谱是一种建立在一定的科学理论基础上的分离方法（工具、手段）。除色谱之外，经典（常见）的分离方法：蒸馏、离心、电泳、过滤、沉淀、萃取等等色谱是一种高效能的分离方法色谱分析以一定的科学理论为基础，在高效能的分离基础上，结合先进的检测方法而建立的现代分析方法。什么是高效液相色谱法？HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色谱法，简称：HPLC是一种区别于经典液相色谱，基于现代仪器方法的高效能分析方法：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度、高选择性的检测器……广泛应用于各个领域：医药/环保/石化/生命科学/食品及农业……在技术、理论及应用上已进入一个较高的水平，并高速发展。HPLC的基本配置及流程溶剂

色谱泵手动/自动进样器

HPLC色谱柱检测器废液数据处理系统

HPLC的仪器配置泵系统自动进样器色谱柱及柱温箱检测器数据处理系统溶剂色谱的发明人­——茨维特（M.S.Tswett）

俄国科学家茨维特1903年利用物质的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法。1906年正式命名色谱法；Chromatography30年代开始广泛研究和应用主要是气相色谱及薄层色谱高效液相色谱法的广泛应用始于70年代色谱的发明人俄国科学家

M.S.Tswett正式命名“色谱”的文献中的一段话一般情况下HPLC不是分析方法的首选

分析方法选择的大致程序（以药典分析方法为例）：

滴定分析（原料药、制剂定量分析）紫外可见光度分析（原料药、制剂定量分析）薄层色谱（鉴别、有关物质检查等；半定量分析）

HPLC（中药饮片、中药制剂的鉴别或有关物质的检查；复杂样品定量分析等）什么情况下使用HPLC？什么情况下使用HPLC？1、对分析结果、测定速度和效率的要求准确度要求：准确定量（RSD<5％）测定速度和效率：快速，单一或多组分测定。2、样品情况样品的复杂情况：HPLC适用于复杂样品的分析，如中药分析、环境分析、体内药物分析、临床药物分析等。HPLC方法建立的前期工作

样品情况的了解：样品的种类（来源）：植物（中草药）、合成中间体、生物样品（血液、尿液、组织匀浆等）……

样品的种类决定了样品的复杂程度（基质影响），从而可初步判定测定的难易程度并且为分析方法的确立设计一个大致的方向。待测成分的性质：极性、水溶性、脂溶性、酸碱性等对方法的建立，有重要的指导意义。待测成分的结构特征：对色谱柱的选择具有一定的指导意义（不是很明显）；对检测器的选择具有指导意义，如：含有生色团（助色团），紫外有吸收，特别是芳香族化合物，可考虑使用紫外检测器待测成分的含量：

决定对柱效的要求（柱效高，可有较低的检测限）决定对检测器灵敏度的要求样品情况的了解：测定成分的数量以及性质相似程度：单一成分的测定，最简单，随着测定成分的增加，分析的难度增加；组分性质的相似程度越高，分析的难度越高。样品情况的了解：问题：组分性质的相差越大，分析的难度越低，是否越有利于多组分分析？查阅有关的文献资料文献资料——有：在文献的基础上，调整、改善。不排除在文献基础上全面创新。文献查阅时应注意的基本内容液相色谱实验所需的基本参数样品预处理方案对照品（标准品）的配制方法流动相：种类及配比，等度或梯度？固定相：色谱柱类型、颗粒大小及内径、长短流动相输送系统参数：流速检测器及相应参数：如紫外检测波长，灵敏度等温度控制进样量以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色谱分析条件。查阅有关的文献资料文献资料——无：结合样品的情况，首先应作一些试探性的工作。（见后面）评价高效液相色谱方法的标准问题：什么样的分离结果是好的？答：用尽可能少的时间和消耗（人力、物力、财力等）满足分析的要求（准确度、灵敏度、分析速度等）。只有更好，没有最好！

理论塔板数n

：分离效率（柱效）的量度理论塔板数计算公式：评价液相色谱方法的标准理论塔板数n

：描述组分被保留的程度以及色谱峰谱带展宽的程度。塔板数越大，柱效越高。W=.5W=2tR=5tR与W是一对矛盾，tR/W可以很好地表达这对矛盾的情况。

影响柱效的因素很多，可以从色谱理论进行分析，如塔板理论、速率理论等，具体内容参见有关教科书或专著。什么是色谱的分离度分离度的公式：R：分离程度的量度简称分离度评价液相色谱方法的标准tR1tR2影响分离度的因素：k、α及n分离度方程：

k

是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱

α是分离因子，描述两个被分离组份容量因子的相对大小。α

＝k2/k1

n是理论塔板数，描述组分被保留的程度以及色谱峰谱带展宽的程度分离度是色谱分离中主要考虑的因素除分离度之外，在设计色谱方法时，以下几个因素也都要考虑：灵敏度载样量分析速度溶剂损耗成本容易使用（简单）色谱柱寿命文献资料查询——无根据评价液相色谱方法的标准，结合样品的情况，作一些试探性的工作根据评价液相色谱方法的标准，

进行试探性工作色谱分析样品预处理的主要目的将待测物质有效地从样品基质中释放出来，制成便于分析测定的稳定液体试样。如：中草药或中成药有效（指标）成分分析；体液中药物或代谢物含量的测定等。除去杂质，纯化样品，防止色谱柱的堵塞。如生物样品中的蛋白质、叶绿素、固体微粒等。富集浓缩样品或进行衍生化，以达到色谱分析的检测限。一、根据了解的样品信息以及分析目的，建立样品预处理方案进行样品预处理的必要性

样品只有成为液体状态才能直接进行HPLC分析。虽然色谱分析具有很强的处理复杂样品的能力，但样品如果过于复杂（如中药饮片、中成药、生物样品分析等），若不进行必要的预处理，则会影响到分析的准确性，并且可能导致测定失败。任何先进的色谱技术都须有先进的样品处理技术相匹配，样品处理技术的适当与否，直接关系到色谱分析的成本、速度和实用性。样品预处理的种类物理的分离与浓缩技术

过滤、沉淀分离、吸附、蒸馏、溶剂的挥发溶剂萃取回流、索氏提取、超声波提取固相萃取（SPE）

吸附剂（硅胶、氧化铝）、高分子大孔树脂（苯乙烯－二乙烯苯）、离子交换树脂、键合硅胶等超临界流体萃取化学衍生化技术HPLC检测器应提供的功能对样品有响应，并有一个输出信号检测器响应值与样品浓度之间在一定的浓度范围内呈线性关系二、选择检测器、确定使用条件HPLC检测器可以分为：溶质性质检测器（Solutepropertydetectors）对溶质的物理或化学性质响应，一般不反映流动相的变化（选择型）整体性质检测器（Bulkpropertydetectors）不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）

没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！不同种类的检测器的分类整体性质示差折光检测器蒸发光散射检测器电导检测器溶质性质荧光检测器固定波长可变波长光电二极管矩阵电化学检测器放射化学检测器氮/硫检测器质谱检测器紫外/可见光检测器理想的HPLC检测器高灵敏度；可忽略基线噪音（信噪比高）宽的线性范围独立于流动相及操作参数的响应对流动相的压力、温度及流速等变化不敏感长时间操作的稳定性低死体积非破坏性选择性（可降低分析组分色谱分离的压力）检测器的灵敏度：信噪比灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N）检测限（LOD）：S/N=3定量限（LOQ）：S/N=10高的信噪比有利于：更好的色谱峰确认更准确的定量更好地完成色谱峰纯度的确认 （较低的阈值）6:1NS常用液相色谱的检测器常规检测器示差折光检测器（RefractiveIndex）紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis）荧光检测器（Fluorescence）蒸发光散射检测器（EvaporativeLightScattering）其他检测器（OtherDetectors）高端检测器光电二极管矩阵检测器（PhotodiodeArrayPDA）质谱检测器（MassSpectrometry）选择液相色谱的检测器要考虑的因素：

你要分离的化合物/样品的化学特性化学结构、分子量及紫外光谱等等流动相的影响溶剂、缓冲盐、改性剂等梯度还是等度（梯度不适于整体性质检测器）准确度要求灵敏度需求是否有双检测的需求HPLC检测器的选择：通用检测器 RIELSD MS灵敏度 mg ng pg 线性范围 104

否 103流速敏感 是 否 是温度敏感 是 是 是破坏性 否 是 是选择性检测器UV/Vis

FL EC MS灵敏度 ng pg fg pg线性范围 105 103 106 103流速敏感 否 否 是 是温度敏感 否 否 是 是破坏性 否 否 是 是UV/Vis检测器目前实验室中最流行的选择约75%的HPLC检测器配备的是UV/Vis（其中50%是可变波长，25%是PDA）吸光度与样品浓度呈线性关系在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大UV/Vis的优点简单、可靠多数人熟悉并喜欢这种技术可以作梯度实验并且是非破坏性的大多数有机化合物有一定程度的吸光度一般来说灵敏度还可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabensat254nm对羟基苯甲酸酯类色谱图UV/Vis的缺点由于不是所有化合物都有紫外可见吸收，因此不是通用检测器（有时也是优点）对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波长检测，或使用折衷的波长受流动相组成的影响：用截止波长以上至少5～10nm作为工作波长缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂（抑制拖尾）也会有影响背景吸收的影响背景吸收降低了线性范围多数流动相有背景紫外吸收实际浓度理想10吸光度210背景吸收荧光（Fluorescence）检测器发荧光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子达到激发态，其返回到基态时发射光的现象即荧光。基态激发态S1S0激发（1）振动能（2）发射（3）1.分子在吸收UV或可见光后进入激发态，分子达到不稳定的高能量状态。2.电子失去过剩的能量成为振动能，并达到最低的激发单重态。3.电子失去能量达到基态时发出荧光共轭及芳香族化合物最容易有荧光现象荧光检测器原理荧光检测器的应用环境中的污染物多环芳烃(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等食品、饮料食品中的毒素；例如：黄曲霉毒素染料维生素及衍生氨基酸生物技术及制药黄曲霉毒素多环芳烃（PAH）维生素荧光检测器的优点选择性提高灵敏度提高（在pg/fg范围）低背景技术mV-0.100.000.100.200.300.400.50Minutes5.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.006.8949.639MDA及MDMA柱上200pgExcitation

=280Emission=360荧光检测器的缺点不是所有化合物都有荧光，需要衍生；检测器对溶解气体及其他淬灭物质（如甲醇）敏感；Ex及Em的最佳，易受温度、溶剂的极性和粘度、溶剂的pH值及样品浓度影响；多数仪器的批次间差异较大，同一型号的不同荧光检测器会得到不同的结果。溶剂中溶解的气体对响应值的影响实例MinutesColumn-PAHColumn@27ºCEluentA:WaterEluentB:AcetonitrileGradient:60%Bto100%Busingcurve9in12minutesHold11minutesBacktoinitialconditionsFlowRate1.2ml/minInjection:20ulTimeprogrammedwavelengthchanges20.521.022.01000MV充分脱气未充分脱气FluorescenceDetector1231.Benzo(b)flouranthene-400ppb2.Benzo(k)fluoranthene-200ppb3.Benzo(a)pyrene-200ppb蒸发光散射（EvaporativeLightScattering）检测器用氮气把流动相吹成细雾状液滴；流动相的液滴通过一个预加热的腔体后被蒸发掉；蒸发的溶剂被除去；溶质的挥发性小于流动相，因此产生颗粒束并与入射光相交，产生散射；散射光在光电倍增管（PMT）上产生信号；PMT的输出与溶质的量呈比

例关系蒸发光散射检测器原理示意图EvaporativeLightScatterin