分子生物学-复制

基因信息的传递地球生命的传奇生命简史TheBigBang150－200亿年MilkyWaygalaxy136亿年solarsystem46亿年TheLifeStory40亿年古细菌、真细菌、真核原生生物TheLifeStory40亿年寒武纪生命大爆炸5－6亿年多细胞生物植物登陆 4亿年 动物登陆 3.6亿年哺乳动物诞生 2.3亿年灵长类动物诞生 5500万－8000万年人类直系祖先诞生700万－500万现代人诞生 5－10万年人类文明史1万年科学家复原的“杜马伊”形象学科简史1859年CharlesRobertDarwin1865年Mendel’sPea1941年OneGene,OneEnzyme1953年DNAdoublehelix1966年GeneticCodeCracked1972年FirstrecombinantDNA1982年Firsttransgenicmice2003年人类基因组测序基本完成分子生物学发展阶段准备和酝酿阶段蛋白质是生命的主要基础物质生物遗传的物质基础是DNA现代分子生物学的建立和发展阶段遗传信息传递——中心法则的建立分子生物学发展阶段初步认识生命本质及改造生命的深入发展阶段重组DNA技术的建立和发展基因组研究的发展单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展基因表达调控机理细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域第十章DNA的生物合成

BiosynthesisofDNA复制过程起始、延伸、终止损伤修复光、切除、重组、SOS修复复制条件其它蛋白酶聚合酶引物酶—引发体连接酶复制特点半保留复制半不连续合成——冈崎片断复制DNA遗传信息亲代——>子代；转录和翻译——基因表达基本的三类RNA制造蛋白质，决定生物的表现型中心法则

thecentraldogma中心法则的补充RNA病毒复制RNA遗传信息亲代——>子代逆转录RNA——>DNADNAdependentDNApolymerase——DDDPDNAdependentRNApolymerase——DDRPRNAdependentRNApolymerase——RDRPRNAdependentDNApolymerase——RDDP第一节复制基本规律

——复制的特点

一、半保留复制semiconservativereplication亲代DNA链为模板，合成子代DNA链子代DNA双链中含一条亲代DNA链

DNA复制机制的三种假说使子代DNA与亲代DNA不同1958年M.Messelson和F.Stahl15N培养基→14N培养基提取DNA，作密度梯度离心

复制基本方式的证明阐明半保留复制的意义从原则上保证了遗传的相对保守性奠定了DNA是遗传物质的地位二、复制起始点originDNA复制从特定的位点起始（复制子）富含AT原核生物一个真核生物多个

三、双向复制

bidirectionalreplication复制起始点为中心，向两个方向同时进行复制微生物中，也可进行单向复制如滚环复制四、需要引物primer

DNAPolymerase不能从头开始只能延伸已有核酸链引物酶Primase合成一小段RNA链(引物)提供3’端自由羟基（3’-OH）引物的大小原核生物:50～100个核苷酸真核生物：约为10个核苷酸

五、半不连续复制DNA聚合酶合成方向5‘——>3’DNA双链逆向平行DNA的解链和复制同时进行5′端3′端CGA5‘——>3’ATAT

TTTTTATATATATTTTTT领头链(leadingstrand)连续随从链(laggingstrand)不连续冈崎片断(Okazakifragment)原核生物1K～2K真核生物100第二节酶学和拓扑学变化

DNA复制的条件

底物&模板解旋解链DNA聚合酶DNA连接酶底物substrate模板templatedATP，dGTP，dCTP，dTTP

DNA复制是模板依赖性的(dNMP)n+1+PPi(dNMP)n+dNTPDNA解链及拓扑学变化解螺旋酶（unwindingenzyme）解链酶或rep蛋白解开DNA双链2ATP/bpbasepair

解螺旋酶引发体和RNA引物引发体: 引发前体+引物酶引发前体:由若干蛋白因子聚合而成DnaA蛋白识别复制起始点，并具有ATPase活性。引物酶特殊的DDRP单链DNA结合蛋白单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）稳定ssDNA，便于复制保护ssDNA，免受核酸酶的降解拓扑异构酶(topoisomerase)拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中的一条链松开双螺旋后再将DNA链连接起来避免出现链的缠绕。拓扑异构酶Ⅱ可切断DNA双链使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。解链过程中正超螺旋的形成DNA聚合酶(DDDP)（一）种类和生理功能：原核生物

DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ）1958年A.KornbergDNA聚合酶Ⅱ（polⅡ）DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ）主力polⅢ由十种亚基组成全酶的核心部分（核心酶）α、ε和θ三种亚基组成α亚基5’→3’聚合活性ε亚基3’→5’外切活性保证DNA复制的精确性/保真性polⅢ无5’→3’外切活性外切酶活性的方向ATTAGCACCAMP+TTAGCACCCMP+ATTAGCAC亚基与模板的结合亚基形成一个围绕DNA的环状钳polⅠ单一肽链可被某些蛋白酶水解为两个片段大片段称为Klenowfragment常用的工具酶323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

原核生物中的三种DNA聚合酶

真核生物五种polα、polβ、polγ、polδ、polεpolα具有引物酶活性polδ主力Polγ参与线粒体DNA复制Polε损伤修复、校读和填补缺口polβ低保真参与应急修复

三、复制保真性的酶学依据碱基配对酶学机制：（一）核酸外切酶活性和及时校读

（二）碱基选择（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读A：切除错配碱基；B：配对正确不表现外切活性。（二）复制的保真性和碱基选择•DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。•嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。

碱基配对碱基选择及时校读DNA复制的保真性DNA连接酶DNA连接酶(DNAligase)催化DNA片段之间磷酸二酯键形成DNA连接酶催化的条件是：3‘-OH，5’-P未封闭的缺口位于双链DNA中（局部）消耗能量原核生物中由NAD+供能真核生物中由ATP供能。HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’DNA连接酶在复制中起接合缺口的作用在DNA修复、重组及剪接中起同样作用基因工程的重要工具酶DNA聚合酶、DNA连接酶、拓扑酶都形成磷酸二酯键区别？小结基本特征origin

semiconservativesemi-discontinuous

Primer主要酶DnaB，ssb，topoPrimaseDNAPolymeraseⅢδDNAligase一、复制的起始预引发：DnaA+DnaB+DnaC+SSB解旋解链，形成复制叉：组装引发体：引发引物酶合成引物 DnaG拓扑酶解旋第三节DNA生物合成过程

oriC结构特征含三组串连重复序列富含AT2对反向重复序列两个相同顺序的互补拷贝在同一DNA链上反向排列而成复制起始识别区二、复制的延长

（一）聚合子代DNA：DNA聚合酶沿模板链3‘→5’方向滑动，在5‘→3’方向聚合子代DNA链（二）引发体移动：引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。

三、复制的终止

（一）去除引物，填补缺口：DNA聚合酶Ⅰ5‘－>3’外切酶活性5’－>3’聚合酶活性（二）连接冈崎片段：在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。

（三）真核生物端粒的形成：端粒（telomere）真核生物染色体末端的结构通常膨大成粒状富含G、T的短重复序列构成末端由于引物RNA的水解而可能缩短端粒酶端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelo