第四章二维电泳与细胞蛋白质的分离

第四章二维电泳

与细胞蛋白质的分离第一节概述电泳技术的基本原理电泳：带电粒子在电场中的定向移动V:泳动速度cm/秒or分d:泳动距离cmt:电泳时间(秒/分)E:电场强度伏特/cm电泳技术的基本原理u:泳动率or泳动度(cm/伏·秒or分)U:电压常压(100—500v)高压(500—10000v)仅需几分钟l:支持场的长度(有效长度)电泳技术的基本原理影响泳动率u的因素内因：1.净电荷2.质点大小3.质点形状

外因：1.V(U/L)2.缓冲液的pH(pH恒定)3.离子强度[I]最适:0.02-0.24.电渗：液体对固体支持物的相对移动电泳技术的基本原理电泳类型

⑴区带电泳纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳包括：垂直板、盘状、等电聚焦、梯度、免疫电泳

⑵自由界面电泳：支持物为溶液，很少用聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide,Bis)在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethylethylenediamine，TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate，AP)或核黄素(ribofavin，VB2)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳原理光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶化学聚合：制小孔胶

过硫酸铵(NH4)2S2O3

APS(引发剂)N,N,N’,N’-四甲基乙二胺TEMED(加速剂)聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

丙烯酰胺反应方程式：

NH

CH2=CH—CONH2+

CH2=CH—CCH2=CH—C—CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2——CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2—CONH2

C=OCH2

NH

NHO

OCONH2C=ONHCH2N,N’-甲叉（亚甲基）双丙烯酰胺聚丙烯酰胺NH聚丙烯酰胺凝胶电泳原理三种物理效应⑴样品浓缩效应

⑵分子筛效应⑶电荷效应聚丙烯酰胺凝胶电泳原理样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。

①凝胶孔径不连续性②缓冲液离子成份的不连续性

③pH的不连续性聚丙烯酰胺凝胶电泳原理①凝胶孔径不连续性单体浓度

交联度

大孔胶:T=3%C=2.0%小孔胶:T=7%C=2.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳原理①凝胶孔径不连续性凝胶网孔大小:聚合链长度:由Acr浓度交联程度:由Acr与Bis相对比例Bis的浓度低,孔径大,可在聚合前调节单体与Bis的浓度比

如:AcrBisT(%)小孔28.0g0.735g7%大孔10.0g2.5g2.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳原理凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关分子量范围适用的凝胶浓度/(%)蛋白质<104 20-301-4×104 15-201-5×104-1×10510-151×1055-10>5×1052-5聚丙烯酰胺凝胶电泳原理②缓冲液离子成份的不连续性

大孔胶pH=6.7先行离子：Cl-存在于凝胶层中任何PH值下随后离子：Gly-存在于电极缓冲液中pI=6.0pKα1=2.34pKα2=9.70在pH=6.7时，只有少数解离为Gly-，多数为Gly+-Pr分子在pH6.7时以Pr-形式存在聚丙烯酰胺凝胶电泳原理③pH的不连续性

pH大孔(浓缩)胶6.7小孔(分离)胶8.9缓冲液8.3聚丙烯酰胺凝胶电泳原理样品浓缩效应（不连续性）

不连续性可控制Gly的解离度，从而控制有效迁移率

迁移率:Cl->Pr->Gly-(Pr被压成薄层)

在大孔胶中：要求Gly的有效迁移率低于所有Pr，经计算pH=6.7在小孔胶中：要求Gly超过所有Pr，Pr留在后面进行普通的电泳与分子筛分离分成多个区带(此pH实测为9.5)电泳过程示意图

A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子

B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带

C显示蛋白质样品分离成数个区带聚丙烯酰胺凝胶电泳原理不连续系统浓缩效应示意图

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高

⑴一般电泳分离的电荷效应带电多，MW小，迁移快

⑵不连续系统对样品的浓缩效应迁移率被压成薄层

⑶凝胶对样品分子的筛选效应SDS测定蛋白质分子量原理

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素1967年，Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfate，简称SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关SDS测定蛋白质分子量原理

蛋白质Pr溶液中加巯基乙醇加SDS,打开氢键与疏水键复合物1.4g：1g加入SDS为SO4-2改变了Pr的荷电性质.SDS测定蛋白质分子量SDS测定蛋白质分子量SDS测定蛋白质分子量原理

各种SDS-Pr均带相同密度的负电荷，其荷电超过了原Pr，消除了不同Pr荷电差异。加入SDS，改变了Pr的构象，SDS-Pr为长椭圆棒，各种短轴约为1.8nm。长轴：Mr，均呈正比例，所以常数斜率迁移率SDS测定蛋白质分子量原理

相对迁移率mR=样品迁移距离cm/染料迁移距离cm标准曲线MW=K（10―bm）1gMW=1gK―bmR=K1―bmR

式中：MW为蛋白质的分子量；K，K1为常数；b为斜率；mR为相对迁移率标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量相对迁移率1D-SDS分离局限性分离度相当有限显示含有单一蛋白质的条带实际可能含有多种蛋白质分子一个纯化的蛋白质可能含有多种蛋白质形式1D-SDS分析看上去纯净的单一条带，相同样品的2D-SDS可将相同分子质量条带分解成具有不同等电点的多点反应了蛋白质的翻译后修饰，化学修饰几乎不影响SDS结合或在PAGE上的迁移二维电泳技术Smithies和Poulik（1956年）最早引入二维电泳技术：将纸电泳和淀粉凝胶电泳结合分离血清蛋白质O’Farrell发明的二维电泳体系根据蛋白质的两个一级属性：等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离（等电聚焦），在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离（SDS）二维电泳技术二维电泳分离后的蛋白质经显色方法（考马斯亮蓝染色、酸性银染、碱性银染、负性染色、荧光染色、放射性标记）处理后，通过图像扫描存档，最后呈现出来的是在二维方向排列的呈“满天星”状排列的小圆的，其中每一个点代表一个蛋白质第二节一维等电聚焦电泳一、IEF凝胶制备一维等电聚焦的基本原理：

把蛋白质加入到含有pH梯度的载体时，如果蛋白质所在的点的pH值与其等电点不符，则该蛋白质会带一定量的正电荷或负电荷。在高于其等电点的位置，蛋白质带负电，反之带正电。此时，如果加以强电场，蛋白分子会在电场作用下分别向正极或负极漂移。当达到其等电点位置时，蛋白质不带电，就不再漂移，被浓缩成狭窄的区带。一、IEF凝胶的制备早期的等电聚焦以低浓度的聚丙烯酰胺凝胶为介质，在外加电场的该介质中，连续排列着从正极到负极pI值逐渐增加的合成载体两性电解质(sythetic

carrier

ampholyte，SCA)当电压加在SCA混合物间，最高pI值的分子（带最多正电荷）移向负极，最低pI值（带最多负电荷）的分子移向正极，其余分子将根据其pI值在两个极值之间分散，从而形成一个连续的pH梯度等电聚焦电泳合成载体两性电解质(1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度；(2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场；(3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开；(4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。SCA的缺陷：SCA本身就是通过复杂的合成过程得到的，其重复性很难控制，这样从一开始就限制了2-DE分离的重复性；SCA分子相对较小，难以在IEF胶内固定，在IEF过程中由水合正离子引起的电渗流将致使SCA分子向负极迁移（负极漂移），导致pH值不稳定性增加。当利用管状IEF胶时，由于玻璃毛细管壁的硅羟基带负电，与这些负电荷基团对应，将在管胶表面聚集一层正电荷形成双电层，这种作用加剧了负极漂移；SCA的缺陷：负极漂移作用对碱性区蛋白质的影响尤其严重，结果常导致碱性区蛋白质难以成功聚焦甚至导致区蛋白质的丢失每一次灌制SCA凝胶的重复性难以控制，凝胶的机械稳定性差，易拉伸变形或断裂，导致重复性的减低固相pH梯度（IPG）技术IPG通过immobiline共价偶联于丙烯酰胺产生固定的pH梯度，克服了IEF的缺点，从而达到高度的重复性

IPG胶条分为线性和非线性线性是指胶条的pH均匀分布非线性是指为了突出某一pH范围的结果，该pH值范围的胶条长度有所增加商品化的IPG胶条IPG胶条的pH值范围的选择一般遵循以下原则：

①pH3~10线性梯度胶适于了解样本中所有蛋白质的分布情况②pH3~10非线性梯度胶能提高pH5~7之间的样本蛋白质解析度③联合使用pH4~7和pH6~11梯度胶可获得相关pH范围的更清晰的蛋白质分布情况④小pH范围梯度胶(pH3.5~4.5，pH4.5~5.5，pH5~6等)可提供高分辨率的蛋白质分布图谱

二、加样在高质量的凝胶基础上进行加样，有两种方案：IPG胶重泡胀后，利用加样杯，边运行等电聚焦，边上样；利用加样杯上样的好处是在于加样量可以提高很多，由于加样杯直接和胶面接触，使得分子量大于100000Da的蛋白质可以有效地进入IPG胶条容易在上样处形成蛋白质沉淀，蛋白质样品易渗漏

二、加样另一种方案是将样品与重泡胀液混合，在IPG胶条泡胀的同时样品也渗入胶条，然后再加电压，即胶内泡胀法其优点是泡胀和等电聚焦整合为一程序即可完成，高效和高可重复性，是目前常用的加样方法因需要泡涨过夜，故蛋白质可能发生溶解或修饰加样量过大三、运行重泡胀完成后，可以加电压开始IEF由于胶条所能承受的电流有限，IEF过程中要避免电流过大，一般限流为50μA最初样品中离子强度高电压应限制于200V、30min，逐步增压，最终电压至8000V并恒定运行若干小时运行时间决定于几个不同因素：样品类型、蛋白上样量、IPG胶条长度、所用pH梯度三、运行获得最好图谱质量和所需最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间聚焦时间短，导致水平和垂直条纹过度聚焦：活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗），会造成蛋白图谱变形在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白质丢失温度低尿素会结晶，IEF应当在20℃运行没有完全聚焦或聚焦时间不够四、IPG胶条的平衡IPG胶条平衡两次，每次15分钟第一步的平衡液50mmol/LTris缓冲液（pH8.8）,含2%SDS、20mmol/LDTT、6mol/L尿素、30％甘油使一向胶条上的蛋白质变性SDS：与蛋白定量结合蛋白质:SDS＝1：1.4四、IPG胶条的平衡尿素，甘油：去除蛋白的高级结构以及亚基间的相互作用减少电内渗，有利于蛋白从第一向到第二向的转移DTT使变性的非烷基化的蛋白处于还原状态四、IPG胶条的平衡第二步平衡液中加入碘乙酰胺以取代DTT使蛋白质巯基烷基化，防止它们在电泳过程中重新氧化碘乙酰胺并且能使残留的DTT烷基化(银染过程中，DTT会导致点拖尾“pointstreaking”)将IPG胶条轻轻润洗，并