第二章 基因工程制药(三)

第二章基因工程制药

(三）1第二章基因工程制药九、基因工程药物的分离纯化基因工程药物或生物技术产品特点：表达产物在初始料中含量较低含有大量细胞及代谢产物表达产物稳定性差，易失活变性表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异对其质量要求纯度高、无菌、无热原2第二章基因工程制药建立分离纯化工艺的依据含目的产物的初始物料的特点物料中杂质种类和性质目的产物特性产品质量要求3第二章基因工程制药含目的产物的初始物料的特点菌种的类型及其代谢特性原材料培养基的来源及其质量生产工艺及条件起始物料的物理、化学和生物学特性4第二章基因工程制药物料中杂质种类和性质相关性和非相关性杂质的含量、化学性质、结构、相对分子质量。电荷性质及数量、生物学性质。稳定性包括对热、pH、盐、有机溶剂等。溶解度、分配系数。挥发性、吸附性能。5第二章基因工程制药目的产物特性

化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性（对热、冷冻、pH、盐、有机溶剂和金属离子等）。疏水性、扩散系数、分配系数、吸附性能。生物活性、亲和性、配基种类及表面活性等。6第二章基因工程制药产品质量要求产品质量指标、用途。对纯度、生物活性、比活的要求。允许的杂质种类和最大允许含量。特殊杂质的种类和最大允许量。产品剂型、贮存稳定性等。7第二章基因工程制药分离纯化的基本过程由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。基因工程药物的分离纯化一般不应超过4～5个步骤。主要包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。8第二章基因工程制药基因工程药物分离纯化的一般流程9第二章基因工程制药细胞破碎与固液分离

细胞收集：离心法、膜分离法。细胞破碎：机械破碎法、非机械破碎法。固液分离10第二章基因工程制药各种组织细胞破碎方法11第二章基因工程制药目的产物的分离纯化12第二章基因工程制药产物的主要特性及在分离纯化中的作用13第二章基因工程制药基因工程药物生产中常用的分离纯化方法14第二章基因工程制药分离纯化工艺应遵循的原则15第二章基因工程制药针对不同产物表达形式采用不同的策略16第二章基因工程制药目标产物分离常用的色谱方法

分离纯化目的产物主要依赖色谱分离技术，常用的有：Ionexchangechromatography(IEC)Affinitychromatography(AC)GelFiltrationChromatography(GFC)Hydrophobicinteractionchromatography(HIC)17第二章基因工程制药针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型18第二章基因工程制药多种分离纯化技术的联合运用19第二章基因工程制药包含体的形成

原核、酵母和真核生物由于异源和同源蛋白过表达形成的致密的不溶性颗粒。包含体的形成与过表达蛋白的内在性质（如分子量、折叠途径等）无直接关系。大肠杆菌胞质环境是一个还原性环境，含有二硫键的蛋白质容易错误折叠形成包含体。20第二章基因工程制药包含体的分离、溶解和复性二硫苏糖醇

21第二章基因工程制药常用蛋白质、酶和重组蛋白质纯化技术22第二章基因工程制药层析分离技术（Chromatography)层析是广泛使用的分离蛋白质的方法，它是根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。目前分离纯化蛋白质常用的层析方法：

离子交换层析亲和层析凝胶过滤层析23第二章基因工程制药离子交换层析（IonExchangeChromatographyIEC）以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。利用蛋白质带电性的差异，在离子吸附剂上静电吸附能力不同，用不同的pH/离子强度洗脱液洗脱，从而使蛋白质分离。具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。24第二章基因工程制药25第二章基因工程制药离子交换介质的基本性质26第二章基因工程制药27第二章基因工程制药28第二章基因工程制药29第二章基因工程制药30第二章基因工程制药离子交换介质的选择原则31第二章基因工程制药离子交换介质的选择原则32第二章基因工程制药离子交换层析的基本操作层析柱平衡平衡缓冲液的用量至少为柱体积的2倍。平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速。平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要。样品进柱为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换量的10～20％，为了避免进样溶液中离子强度过高，样品浓度不宜太高。交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能集团的总数。33第二章基因工程制药离子交换层析需注意的问题34第二章基因工程制药离子交换层析的应用

20种氨基酸中大部分带正电或负电，这是IEC应用范围广的原因。IEC处理量大，附载系数高，一步缩小样品体积很多。IEC去除杂质能力强，如对热原、核酸、外毒素等。利用蛋白质在不同pH和盐浓度下带电性的不同，分两步IEC使目标蛋白达到提纯目的。IEC原则上讲可放在纯化工艺的任何一步，它属于吸附层析，单步损失也较大。35第二章基因工程制药亲和层析（AffinityChromatography，AC）

亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。36第二章基因工程制药亲和层析配基：在亲和层析中起可逆性结合的特异性物质。载体：与配基结合的支撑物。亲和层析大体可分三步：配基固定化吸附目的物样品解吸37第二章基因工程制药亲和层析的特点AC具有分离纯化目标单一，回收率高的特点。从理论上讲，AC得到的是相当纯的产物，这种分离能力是其它任何柱层析都难以相比的。AC柱制作工艺复杂，同时在色谱洗脱过程中配体不可避免的脱落，不但柱子的寿命有限，而且必须经特别处理才能注射或服用，因此成本比较昂贵，一般不放在纯化工艺的前面。38第二章基因工程制药凝胶过滤（GelFiltrationChromatography）

凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。39第二章基因工程制药凝胶过滤根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异，可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。主要应用两个方面：

脱盐和更换缓冲液蛋白质分子的分级分离。在产品的形成阶段前用于除去产物的多聚体及降解产物。40第二章基因工程制药疏水层析（HydrophobicInteractionChromatography，HIC）以蛋白质疏水性为分离基础。通过表面疏水性差异分离蛋白质。疏水键的形成对于非极性基双方无特异性要求，不同蛋白质表面及内部疏水区的多少、大小、强弱、分布及空间位阻效应各不相同，这也是HIC分离蛋白质的根本所在。在20种氨基酸中有8种是疏水性氨基酸，其强弱为：色氨酸（Trp）、异亮氨酸（ILe）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸(Pro)、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、蛋氨酸（Met）、丙氨酸（Ala）。41第二章基因工程制药影响HIC的因素42第二章基因工程制药HIC的应用43第二章基因工程制药非蛋白质杂质的去除主要包括：DNA、热原质和病毒的纯化方法。DNA的去除：DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。44第二章基因工程制药非蛋白质杂质的去除热原质的去除：热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。病毒的去除：层析或过滤可将病毒去除。45第二章基因工程制药浓缩、干燥和保存蛋白质的浓缩：

减压加温蒸发浓缩空气流动蒸发浓缩冷冻法吸收法超滤法沉淀法46第二章基因工程制药浓缩、干燥和保存47第二章基因工程制药浓缩、干燥和保存48第二章基因工程制药十、基因工程药物的质量控制

基因工程药物的特点：用活细胞作为表达体系，所获得的蛋白质产品往往相对分子量较大，并有复杂的结构，许多药物是参与一些生理功能精密调节所必需的蛋白质，所以任何药物在性质或剂量上的偏差，都可能造成严重的后果，从原料开始每一步都要进行严格的控制。49第二章基因工程制药基因工程药物的质量控制

宿主细胞中表达的外源基因，在转录翻译精制工艺放大过程中都可能发生变化，故从原料以及制备全过程都必须严格控制条件和鉴定质量。50第二章基因工程制药原料的质量控制

原料的质量控制是为了保证编码药品的DNA序列的正确性，以及产品质量的安全性和一致性。明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列予以确证；应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分（如复制子、启动子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记物；51第二章基因工程制药原料的质量控制应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性；须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中启动与控制基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。52第二章基因工程制药培养过程的质量控制

在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。53第二章基因工程制药培养过程的质量控制生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含有致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。54第二章基因工程制药培养过程的质量控制对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定最高允许传种代数；在培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；55第二章基因工程制药培养过程的质量控制依宿主细胞-载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品。培养周期结束时，应监测宿主细胞-载体系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含插入基因载体的酶切图谱等。56第二章基因工程制药纯化工艺过程的质量控制要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热源质都在规定的限度以下。在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质。57第二章基因工程制药目标产品的质量控制目标产物的质量控制主要包括以下几项要求:产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。它需要利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多学科的理论与技术所建立的鉴定方法。58第二章基因工程制药产品的鉴别

常用的鉴别方法：电泳方法:SDS、等电聚焦、免疫电泳；免疫学方法:放射免疫(RIA)、酶联免疫(ELISA)；受体结合试验；高效液相色谱(HPLC)；肽图分析法；末端序列分析；圆二色谱；核磁共振等。59第二章基因工程制药产品的鉴别肽图分析：肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质,对生成的肽段进行分离分析。检测蛋白质一级结构最有效的方法。该技